魏红，童嘉毅，范国峰，冯毅，李鹏

（1.东南大学医院，南京 210018；2.东南大学 附属中大医院，南京 2100092；3.南京大学医学院 附属鼓楼医院，南京 210008）

急性心肌梗死是全球范围内严重威胁人类健康的临床常见病。药物治疗和血运重建技术的不断发展，使急性心肌梗死的死亡率明显降低，但对心肌梗死后心力衰竭仍无有效的治疗手段。近年来，许多临床研究提示干细胞移植治疗缺血性心脏病，能够改善心肌功能，但治疗效果仍不肯定，甚至相互矛盾。本课题组初步动物实验结果表明，超声介导微泡能够增加猪骨髓单个核干细胞归巢至局部梗死心肌的能力，远期心功能得到明显改善［1，2］，并且对移植干细胞增殖、凋亡和细胞周期无不良影响［3］。然而，超声介导微泡增强移植干细胞靶向归巢的机制仍不明确。本实验观察超声介导微泡对内皮组细胞（endothelial progenitor cells，EPCs） 生成一氧化氮（nitric oxide，NO）的量及一氧化氮合酶（nitrogen synthase，NOS）活性的影响，以了解其增效干细胞治疗的机制，从而进一步指导实验和临床研究。

1 材料与方法

1．1 主要试剂和设备

淋巴细胞分离液Ficoll-Paque（天津灏洋生物公司），培养液 EGM-2（Cambrex），纤维连接蛋白（Fn，Chemicon）；Di I标记乙酰化低密度脂蛋白（Di I-acLDL，Molecular Probe），FITC 标记荆 豆 凝集 素 I（FITC-UEA-I，Sigma），硝酸还原酶法测定NO试剂盒（南京建成生物工程研究所），NOS分型测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），含氟碳气体脂质体微泡（东南大学生物工程材料国家重点实验室），荧光正立显微镜（Nicon），CZT-3超声同步治疗仪（沈阳新乐康复医疗仪器厂），3722N型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 细胞分离、培养和鉴定

于雄性猪（2月龄中国家猪，东南大学实验动物中心提供）胫骨近端抽取骨髓约20 ml，加入Ficoll-Paque分离液，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，以3×105/ml的密度，接种于铺有Fn的培养瓶中，培养液用EGM-2。培养至7 d行DiLacLDL和FITC-UEA-I双染色，记数双阳性细胞为EPCs。

1.3 内皮祖细胞的分组和干预

培养细胞分为3组：对照组、超声组和超声微泡组。实验前将培养的EPCs用胰酶消化，制成单细胞悬液，摇匀后以100μl（约5×105/ml）加入96孔培养板。对照组不做干预，超声组以频率1 MHz，输出功率1W/cm2，持续辐照90 s；超声微泡组加入5μl微泡（约 2×108/ml），以同样超声条件作用 90 s。96 孔培养板固定在37℃双蒸水水槽表面，超声探头垂直置于培养板下方约8 cm处，为避免超声波对邻近孔细胞的影响，隔孔接种细胞，每组8孔。干预后分别收集细胞和上清液。

1．4 内皮祖细胞生成NO和NOS活力测定

应用NO试剂盒通过硝酸还原酶法检测EPCs上清液NO含量；应用NOS分型测定试剂盒测定EPCs细胞内结构型NOS（cNOS）和诱导型NOS（iNOS）的含量。

1.5 统计学分析

采用SPSS14.0统计软件包进行数据分析，所有数据用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Student Newman Keuls（S-NK）检验，P﹤0.05为有统计学差异。

2 结果

2．1 内皮祖细胞的鉴定结果

培养7 d，贴壁细胞形态以梭形为主，可见圆形及不规则形细胞。荧光显微镜下，细胞摄取DiLac LDL后呈红色，FITC-UEA-I染色后呈绿色，双染色细胞的EPCs占90%以上（图1）。

2．2 超声联合微泡对EPCs生成NO的影响

硝酸还原酶法检测EPCs干预后的上清液，结果表明：超声组为（70.43±9.52）μmol/L，与对照组（72.85±9.08）μmol/L无显著性差异；超声微泡组为（88.70±8.78）μmol/L，与对照组和超声组均有显著性增加（P<0.05）。

2．3 超声联合微泡对EPCs各型NOS活力的影响

对照组、超声组和超声微泡组T-NOS活力分别为（8.33±1.05）U/ml、（7.81±0.82）U/ml、（15.60±1.26）U/ml；i-NOS 活力 3 组分别为 （5.50±0.47）U/ml、（5.25±0.50）U/ml、（10.81±0.95）U/ml；T-NOS 活力减去i-NOS可得到c-NOS活力分别为（2.82±0.24）U/ml、（2.56±0.30）U/ml、（4.78±0.36）U/ml。统计学分析表明，超声组各型NOS活力较对照组有所下降，但差异无统计学意义；而超声微泡组i-NOS和c-NOS活力较对照组有显著性增加（P<0.05），又以i-NOS增加更明显（图2）。

3 讨论

移植干细胞治疗缺血性心肌病的关键是移植细胞到达缺血区并存活，并进一步分化为心肌细胞或发挥旁分泌治疗作用。NO是体内活性气体分子，有广泛生理病理作用，包括调节血管舒张功能，抗血小板聚集，增加血管通透性，促进血管新生，调节其他促血管生长因子功能。体内NO由NOS催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应生成。不同类型细胞中，存在不同类型的NOS，通过不同的信号转导机制产生NO。现已知NOS有3种类型，广义的将其分为2种，即构成型一氧化氮合酶（cNOS）和细胞因子诱导型（iNOS）。cNOS包括主要分布在内皮组织的eNOS和神经系统的nNOS，合成基础NO，调节生理功能。iNOS在静息细胞内不表达，当细胞受到细胞因子或炎性刺激时，催化合成非生理浓度的大量NO。

本实验结果证实，超声介导微泡作用下EPCs生成NO明显增加，EPCs各亚型NOS活性均有所增强，又以i-NOS增加更明显。可以推测，体内血管局部NO浓度增加，从而引起血管扩张，血流速度减慢，有利于EPCs边集。近期实验表明［4］，NO能够降解内皮层钙黏蛋白复合物，激活金属蛋白酶-9（MMP-9）降解细胞外基质，使血管通透性增加，促进EPCs游出血管，在心肌组织间迁移。此外，动物实验表明［5，6］，心肌局部 NO 生成增加，能够增强大鼠心肌梗死区血管新生，改善心肌纤维化和心功能，提高生存率。

eNOS在EPCs迁移、分化形成微血管中也起重要作用。Sasaki等［7］应用eNOS增强子AVE9488体外预处理EPCs，eNOS mRNA表达增加，相应酶活性增强，结果使干细胞迁移能力明显提高；体内实验进一步表明上述预处理移植EPCs能够明显增加缺血后肢新生血管密度和血流灌注，改善后肢运动功能。而且NOS活性对心肌缺血和再灌注损伤也有保护作用，其机制可能与移植EPCs的eNOS、iNOS活性和分泌VEGF有关，其中eNOS对一过性缺血，iNOS对慢性持续缺血有抗炎性作用［8］。

综上所述，超声（1 MHz，1W/cm2，90 s）介导微泡能够增强EPCs的NOS活性，增加NO生成，可能影响EPCs的黏附、迁移、存活、增殖和分化的各个环节，从而发挥增强干细胞治疗心肌梗死的作用。目前该作用的具体机制尚不明确，尚需相关实验进一步深入研究。

［1］童嘉毅，马根山，冯毅，等．超声波促骨髓间充质干细胞心肌内归巢的实验研究［J］．中国心血管病研究杂志，2008，6（10）：771-773．

［2］徐琢，冯毅，童嘉毅，等．超声微泡辅助干细胞移植治疗急性心肌梗死的实验研究［J］．东南大学学报（医学版），2008，27（3）：192-194．

［3］范国峰，冯毅，童嘉毅，等．超声联合微泡对内皮祖细胞体外增殖、凋亡及细胞周期的影响［J］．东南大学学报（医学版），2009，30（2）：109-112．

［4］Dong Y，Ludovic W，Téni G，et al.Increase in vascular permeability and vasodilation are critical for proangiogenic effects of stem cell therapy［J］．Circulation，2006，114（4）：328-338．

［5］Landmesser U，Engberding N，Bahlmann FH，et al．Statin-induced improvement of endothelial progenitor cell mobilization，myocardial neovascularization，left ventricular function，and survival after experimental myocardial infarction requires endothelial nitric oxide synthase［J］．Circulation，2004，110（14）：1933-1939．

［6］Bulhak AA，Sjoquist PO，Xu CB，et al．Protection against myocardial ischaemia/reperfusion injury by PPAR-alpha activation is related to productionofnitricoxideand endothelin-1［J］．Basic ResCardiol，2006，101（3）：244-252．

［7］Sasaki K，Heeschen C，Aicher A，et al．Ex vivo pretreatment of bone marrow mononuclear cells with endothelial NO synthase enhancer AVE9488 enhances their functional activity for cell therapy［J］．Proc Nat Acad Sci USA，2006，103（39）：14537-14541.

［8］Masaaki I，Hiromi N，Atsushi I，et al．Endothelial progenitor cells are rapidly recruited to myocardium and mediate protective effect of ischemic preconditioning via“imported”nitric oxide synthase activity［J］．Circulation，2005，111（9）：1114-1120．