王铜浩，杨茂伟，颜培培，初立伟，高志达

（中国医科大学 附属第一医院 1.骨科；2.内分泌科，沈阳 110001）

老年痴呆症，又称阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，简称AD），是一种神经退行性疾病。目前，在临床研究中有关AD患者体内细胞因子的研究已有很多报道［1~2］，但其变化规律以及姜黄素治疗剂量对其变化规律影响的研究尚不多见。APP/PS1转基因鼠（β淀粉样蛋白前体蛋白/早老素1）可表达与AD相关的突变基因，是研究AD及其并发症有力的动物模型［3］。姜黄素（curcumin）是从姜科植物姜黄中提取的一种酚类物质，具有抗炎、抗氧化、减少小胶质细胞形成、能改善AD病人的认知功能［4］，本实验以APP/PS1转基因鼠做为AD模型，通过检测鼠模型应用姜黄素治疗前后脑及血清中的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的含量，探讨 APP/PS1 转基因鼠体内细胞因子TNF-α和IL-6的变化规律以及不同药量的姜黄素对其变化规律的影响，为AD防治方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

动物：6月龄雌性APP/PS1转基因小鼠（B6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/J，购自美国 Jackson Laboratory），经过常规饲养，传代后选择体质量（20±1）g小鼠36只，再从中随机选取9只小鼠作为模型组，其余27只小鼠随机分为3组作为用药组，除常规饮食外，姜黄素（Sigma公司，纯度>96%）按60，160，600 mg·kg-1加入小鼠饲料，自由饮水。6 月龄雌性野生型小鼠（C57bl/6）9只，（20±1）g为对照组。各组小鼠分笼饲养，常规饮食，室温23～25℃，12 h间隔照明，定期紫外线消毒与通风。

1.2 方法

1.2.1 取材及标本制备：每组小鼠各取3只分别于9、12、18月龄时处死，无菌取大脑、血浆，大脑匀浆后上清液和血浆离心后的血清于-80℃保存备测。

1.2.2 检测方法：分别应用Quick EIATM小鼠TNF-αELISA试剂盒和Quick EIATM小鼠IL-6 ELISA试剂盒（Dakewe biotech Company Limited）检测各年龄段小鼠脑组织上清液和血清中的细胞因子TNF-α和IL-6表达水平，按照试剂盒要求进行操作，检测程序和结果计算与判断基本相同。

1.2.3 结果计算与判断：（1）所有OD值都应减除空白值后再行计算。（2）以标准品之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。（3）根据样品值在该线图上查出相应小鼠TNF-α和IL-6含量。

1.3 统计学分析

使用SPSS13.0统计软件进行分析检验，所有数值以x±s的形式表示，两样本均数比较用t检验，多样本均数比较采用ANOVA进行分析，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

应用ELISA技术分别于9、12、18月龄时检测各组小鼠的脑组织和血清中的细胞因子TNF-α和IL-6表达水平，结果见表1。

表1 姜黄素对APP/PS1转基因鼠TNF-α、IL-6的影响Tab.1 The effect of curcumin on TNF-αand IL-6 in APP/PS1 transgenic mice

与对照组（野生型小鼠）相比，模型组（APP/PS1转基因鼠）脑组织和血清中的TNF-α和IL-6于9月龄时开始升高，且IL-6的变化出现统计学差异（P＜0.05）；12月龄差异有统计学意义（P＜0.05）；18月龄差异有统计学意义（P＜0.01），并且转基因小鼠体内的炎性因子随着年龄的增长，病情的加重出现上升趋势，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

与模型组相比，用药组姜黄素60 mg·kg-1脑组织和血清中的TNF-α和IL-6表达水平降低；姜黄素160 mg·kg-1出现显著性差异（P<0.05）；姜黄素 600 mg·kg-1差异更加显著（P<0.01），TNF-α 和 IL-6 的含量接近对照组（P ＞ 0.05）；姜黄素 600 mg·kg-1各年龄段小鼠相比，TNF-α和IL-6含量无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨论

临床研究显示细胞因子在AD的神经病理损伤过程中起重要作用［1］。对AD患者的病历检查结果证实，海马各区TNF-α呈高表达，并认为它是介导AD脑内炎性病理反应的关键性因子，对AD患者的皮质研究发现，IL-6的脑内表达也显著增多。因此，若能抑制TNF-α和IL-6的分泌，就可减慢甚至调整这种恶性循环，从而减少脑神经细胞的死亡或凋亡，而达到防治AD的目的。

大量的研究证据表明姜黄素可以抑制AD患者脑内 β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）的沉积，改善AD患者的免疫功能［5］，更重要的是姜黄素具有抗炎和抗氧化的作用［6］。Yang等［7］研究发现姜黄素可通过调节APP/PS1转基因小鼠体内的炎性因子而改善其骨微结构，可见炎性因子对AD及其并发症有着重要的作用。因此，本实验以APP/PS1转基因小鼠做为AD模型，探讨了转基因鼠随着病情的发展，体内细胞因子TNF-α和IL-6的变化规律，以及不同药量的姜黄素对其变化规律的影响。

通过对比实验数据可发现与野生型小鼠相比，APP/PS1转基因鼠脑组织、血清中的TNF-α和IL-6于9月龄时开始升高，12月龄时差异显著（P<0.05），18月龄时差异更加显著（P<0.01）。有研究发现APP/PS1转基因小鼠在9月龄时开始表达Aβ，并随着年龄的增加表达升高［8］，由此可见转基因小鼠体内的TNF-α和IL-6的变化趋势可能和Aβ的表达密切相关，而Aβ是淀粉样前体蛋白（APP）基因编码的产物是，Aβ出现以后一方面可刺激大脑局部的单核巨噬细胞和小胶质细胞产生TNF-α和IL-6［9］，同时由于其血脑屏障局部功能发生改变，使局部升高TNF-α和IL-6进入体循环；另一方面Aβ的表达可导致免疫系统功能的改变，与局部的炎性应答相互作用，从而导致了机体细胞因子的升高。因此可间接推测APP/PS1转基因小鼠体内TNF-α和IL-6的表达升高和APP、PS1基因存在一定的关联。

应用姜黄素60 mg·kg-1治疗后，APP/PS1转基因鼠脑组织、血清中TNF-α和IL-6表达水平降低，160 mg·kg-1治疗后出现显著性差异（P<0.05），600 mg·kg-1时差异更加显著（P<0.01）。可见应用姜黄素剂量600 mg·kg-1时能够有效的抑制APP/PS1转基因鼠体内的细胞毒性因子的产生。研究［10］证实姜黄素用药在150～750 mg·kg-1对治疗去势后小鼠的骨质疏松效果显著，且无毒副作用。本实验中姜黄素的最高用药量为600 mg·kg-1，小鼠估计摄入量为 1.2～12 mg·kg-1，2 000 mg·kg-1是姜黄素毒性临界值［11］，该值远远大于我们的用药量，因此600 mg·kg-1用药量对生物体几乎毒害作用，且较非甾体等其它抗炎药。姜黄素负面作用更低。所以每组小鼠都不存在死亡率。Baum等［12］研究发现姜黄素在AD患者脑内可做为螯合剂结合Aβ周围的铁、铜离子，从而加速Aβ的降解。在体内研究还发现姜黄素可抑制氧化应激反应，保护细胞免受Aβ的攻击。因此姜黄素可通过影响Aβ的表达，抑制APP/PS1转基因鼠体内的炎性反应，降低TNF-α和IL-6的含量，从而可有效缓解AD的病情。

上述研究提示APP/PS1转基因小鼠可通过表达突变的APP、PS1基因编码Aβ，Aβ的形成和发展导致了转基因小鼠体内细胞因子TNF-α及IL-6的升高，在阐明转基因小鼠体内细胞因子变化规律的同时，探讨了不同药量的姜黄素对其变化规律的影响，为在人体中进一步研究AD的防治奠定了基础。

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