张晗，尚云晓

（中国医科大学 附属盛京医院儿科，沈阳 110004）

支气管哮喘（简称哮喘）是由多种因素共同参与的气道慢性炎症［1］。近年来，气道的神经源性炎症日益引起关注。神经源性炎症是指由气道感觉神经末梢释放的感觉神经肽所介导的炎症。参与哮喘发病的感觉神经肽主要有神经激肽A（neuropeptide A，NKA）、P 物质（substance P，SP）、神经激肽 B（neuropeptide B，NKB）。他们主要通过引起平滑肌收缩，增加血浆外渗，促进黏液高分泌及促进炎性介质释放等作用参与哮喘的病理生理过程［1］。随着人们对哮喘神经机制认识的日益深入，人们发现NKA、SP、NKB并非直接发挥作用，而是通过特异的细胞受体而发挥生物活性。目前主要有3种感觉神经肽受体亚型被鉴定出，即NK1、NK2和NK3受体。其中，NKA主要通过NK2受体而发挥生物学活性，同哮喘气道高反应的形成关系密切，目前被认为是哮喘的神经机制中最重要的受体之一。有学者认为速激肽及相关受体含量增加以及二者的相互作用可能是气道高反应性及慢性炎症存在的原因［2］。因此，研究速激肽受体意义更大。本实验采用原位杂交和反转录多聚酶链式反应着重研究NK2受体mRNA在哮喘豚鼠气管和肺组织中的分布和相对含量。探讨NK2受体与哮喘的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

动物模型的制作及分组［3］：将同条件豚鼠按雌雄各半随机分为以下各组进行研究：（1）哮喘组：按卵蛋白吸入法制作豚鼠哮喘模型。将单只豚鼠置于半封闭的容器中，于1，4，7 d分别超声雾化吸入1%卵蛋白各3 min使其致敏，然后21 d超声雾化吸入2%卵蛋白5 min激发诱喘，直至诱喘成功（豚鼠出现呼吸加快，甚至呼吸困难，听诊可闻及双肺哮鸣音）24 h后统一取材；（2）正常对照组：用生理盐水替代卵蛋白吸入（方法见上）。每组10只豚鼠，种属、月龄、体质量一致。

1.2 研究方法

1.2.1 动物标本取材：常规诱喘后24 h内统一取材（研究组与对照组取材时间一致），取材前以戊巴比妥腹腔注射麻醉。以专用器械（高温高压灭菌）取器官及肺组织，置高温高压灭菌管中-70℃冻存；另取部分组织用含DEPC的4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片。

1.2.2 用原位杂交检测气管肺组织NK2受体mRNA的分布：在组织切片上（石蜡切片），用原位杂交技术（检测方法严格按试剂盒要求），观察各组NK2受体mRNA在气管及肺内表达部位及分布。组织经固定（4%多聚甲醛，含1/1 000 DEPC），常规脱水，浸蜡，包埋。涂多聚赖氨酸处理，石蜡切片常规脱蜡至水，暴露NK2受体mRNA核酸片段，预杂交，杂交，依次滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化过氧化物酶，DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。在显微镜下观察NK2受体mRNA其表达的部位，有NK2受体mRNA表达的细胞着棕黄色。每只豚鼠肺组织及气管各选一张切片，随机选取正常组9只，哮喘组8只，于镜下随机选取3个视野（气管或支气管周围），每个视野随机选取一个气管黏膜下和平滑肌周围部位，于400倍条件下照相，利用美国universal imaging porporation图像分析系统，meta morph软件测定其光强度（integrated ODtotal）作为NK2受体mRNA的相对含量。具体方法如下：任意选取任意一个到两个部位作为标准，用分析仪选取阳性细胞着色率达90%时红黄蓝达到的色差百分比作为标准，得到每张切片上的不同部位的NK2受体mRNA的光密度作为相对含量及阳性细胞着色相对百分比。

1.2.3 肺组织NK2受体mRNA的检测：用反转录多聚酶链式反应按试剂盒方法检测。按总RNA提取试剂盒要求提取肺组织总RNA，取总RNA3μl用于cDNA第一链的合成，NK2受体扩增片段222 bp上游 5′CCGACCGAGGAA GATAAG 3′；下游 5′TCA ACTGGA TGCCTTTGC 3′；取 cDNA 3 μl用于 PCR扩增，在扩增体系中加入如下试剂：H2O 16.9μl，10×buffer 2.5 μl，dNTP 3.2 μl，Tag-E 0.2 μl，NK2上游引物0.2μl，NK2下游引物0.2μl；混匀后按下列条件扩增：94℃3 min→94℃45 s→53.5℃1 min→72℃1 min→72℃7 min，共35个循环。总RNA提取试剂盒由Promega公司提供，TakaRa反转录试剂盒由TaKaRa公司提供，NK2受体引物由北京奥科生物技术有限公司合成。扩增产物经2%琼脂凝胶电泳后，紫外线等下观察，照相。用凝胶成像分析系统扫描扩增带，以内参照标准化NK2受体值，得到NK2受体的相对含量。

1.3 统计学分析

所有数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行统计学分析，组间差异采用t检验，P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 NK2受体mRNA在哮喘豚鼠气道内的表达

光镜下哮喘豚鼠气管、支气管及肺组织中均可见到有NK2受体mRNA的表达明显，着色呈棕黄色，主要分布于气管、支气管的纤毛黏膜下平滑肌周围；肺实质和间质及血管周围也有少量表达。正常对照组在上述部位表达微弱。见图1。

2.2 NK2受体mRNA相对含量

哮喘豚鼠气管黏膜下和平滑肌周围NK2受体mRNA相对含量（9.339±0.817 7）较正常对照组（2.265±0.74）明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），见图 2。

哮喘豚鼠肺组织中NK2受体mRNA的表达的含量（1.046±0.112）较正常对照组（0.796±0.301）显著增高，有统计学差异（P<0.05），见图3，图4。

3 讨论

支气管哮喘（简称哮喘）是小儿常见的慢性肺部疾病，发病机制极其复杂，迄今尚不清楚。据2006年全球哮喘防治会议（global initiative for asthma，GINA）认为哮喘是一种气道慢性炎症疾患，此中许多细胞和细胞组分起到重要作用，并伴有气道反应性的增加，呼吸道的神经调节可能参与气道炎症过程和气道口径的调节，呼吸道炎症和呼吸道神经调节的异常可能与哮喘的反复发作有关。炎症反应和神经调节在不同的病人中或同一个病人中所起作用不同，或在同一个病人的不同疾病时期所起的作用也不同，在慢性呼吸道炎症和哮喘反复发作两者中包含着免疫和非免疫的机制。气道高反应性是哮喘的基本特征，气道慢性炎症是哮喘的基本病变。随着对哮喘的进一步研究，哮喘的神经机制日益受到重视。目前认为由肺内感觉神经末稍释放的神经肽所介导的神经源性炎症可能在哮喘发病机制中起到重要作用［2，3］。目前研究认为，气道的神经调节除了经典的胆碱能和肾上腺素能神经系统外，还存在一种称为非肾上腺素能，非胆碱能（NANC）神经系统。NANC神经分为非肾上腺素能、非胆碱能的抑制神经（NANCi）和兴奋神经（NANCe），前者兴奋具有舒张平滑肌的作用，其递质是血管活性肠肽（VIP）及一氧化氮（NO）；而后者受到刺激后具有强烈的收缩气道平滑肌之效应。现认为非肾上腺素非碱胆能兴奋性神经通道是由无髓鞘传入迷走神经纤维构成，其递质是感觉神经肽。目前认为与哮喘关系较为密切且研究较多的感觉神经肽有NKA，NKB，P物质，又由于三者有迅速收缩气道平滑肌之作用，故又称为速激肽［4］。他们主要通过引起平滑肌收缩，增加血浆外渗，促进黏液高分泌及促进炎症介质释放等作用参与哮喘的病理生理过程［5］。研究认为NKA是重要的感觉神经肽之一，是哮喘患者支气管肺泡灌洗液（BALF）中主要的速激肽，浓度很高，且在抗原激发后显著增高［4］。NKA是在三者中收缩气道平滑肌的作用最强，这可能同NKA免疫反应神经在支气管平滑肌有很广泛的分布有关，同时NKA也有增加气道微血管渗出及黏液分泌的作用。尚云晓等［6］研究已证实小儿哮喘发作期血中NKA含量明显增高，病情越重增高越明显，随哮喘症状缓解血中NKA含量下降至正常水平，血中NKA含量的变化与小儿哮喘的发作及缓解关系密切。随着人们对哮喘神经机制认识的日益加深，人们发现NKA、SP、NKB并非直接发挥作用，而是通过特异的细胞受体而发挥生物活性。目前主要3种感觉神经肽受体亚型被鉴定出，即NK1、NK2和NK3受体。其中，NKA主要通过NK2受体而生物学活性，目前在哮喘的神经机制中NK2受体被认为是最重要的受体之一，同哮喘气道高反应的形成关系密切［7，8］。NK2受体属于G蛋白耦联受体家族成员，各自由一条7次穿膜的肽链构成。速激肽同其相应受体特异性结合后，Gp蛋白被激活，随之由第二信使三磷酸肌醇（IP3），钙离子-钙调蛋白酶途径导致平滑肌收缩，气道周围微血管扩张，增加血浆外渗，促进黏液高分泌及促进炎症介质释放等。目前认为速激肽受体及相关配体通过上述反应参与哮喘的病理生理过程［5］。随着人们对哮喘神经肽受体的进一步研究发现，NK2受体主要分布于支气管平滑肌上，其相应的配体为NKA，NKA收缩平滑肌的作用最强，因此NK2受体必然参与这种反应，NK2受体引起人外周气道的收缩反应最强［9，10］。同时，Rodger等［11］在实验中发现在豚鼠的支气管及肺实质的细支气管，NK2受体也有促进黏液分泌的作用。在研究速激肽受体与哮喘类型的研究中发现，NK2受体主要参与迟发型哮喘的发生［12］。我们的实验采用两种不同的方法，其研究结果表明哮喘豚鼠NK2受体mRNA在气管、支气管及肺组织中均可见到有表达，主要分布于气管、支气管的纤毛黏膜下平滑肌周围；肺实质和间质及血管周围也有少量表达。并且哮喘肺组织中NK2受体mRNA含量却是较正常对照组显著增高，本研究结果证实，肺组织中NK2受体mRNA含量变化与卵蛋白致敏后诱发的豚鼠哮喘关系极为密切，提示NK2受体参与了哮喘的发病机制，同Bait等［7］认为哮喘患者NK2受体显著上调结论是一致的。因此速激肽及相关受体含量增加以及二者的相互作用可能是气道高反应性及慢性炎症存在的原因。

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