APP下载

高氧诱导新生鼠肺纤维化中CDK2及P27的表达和意义

2010-05-25于晓岩孙艳丽胡瑜富建华

中国医科大学学报 2010年10期
关键词:肺纤维化细胞周期灰度

于晓岩,孙艳丽,胡瑜,富建华

(中国医科大学附属盛京医院儿科,沈阳110004)

慢性肺疾病(chronic lung disease,CLD)是患有心肺疾病的新生儿,特别是早产儿,由于长时间吸入高浓度氧或高容量、高压力的机械通气等治疗因素共同作用于未成熟肺,而导致的一种严重的肺部并发症。其特征性病理变化为:早期肺泡炎性反应和晚期不可逆的肺间质纤维化。到目前为止,关于CLD确切发病机制尚无定论,因此也缺乏有效的防治手段,故探索CLD肺纤维化的发生机制成为当今新生儿领域亟待解决的问题。现研究认为,肺成纤维细胞异常增殖,造成细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成及降解失衡是高氧致CLD肺纤维化发生的根源,而调节细胞增殖的最终环节又发生在细胞周期水平上。因此,本实验采用高氧诱导新生大鼠肺纤维化模型,研究细胞周期依赖蛋白激酶2(cyclin-dependent kinase-2,CDK2)及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,P27)的动态表达变化及其对CLD肺纤维化的影响作用。

1 材料与方法

1.1 材料

选用足月新生Wistar大鼠64只(由中国医科大学附属盛京医院实验动物部提供)。主要试剂:兔抗大鼠CDK2单克隆抗体、小鼠抗大鼠P27单克隆抗体购自Santa Cruz公司;SP免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司;RNAisoTMPlus、PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBRRPremix Ex TaqTM均购自 Takara 大连宝生物技术有限公司;引物由Takara大连宝生物技术有限公司合成。主要仪器:氧箱,测氧仪(美国生产型号为OM-ME),Dapex气体分析仪,美国Universal Imagining Porppration图像分析系统。

1.2 方法

1.2.1 模型的制备:将新生大鼠依据吸入氧浓度随机分为实验组和对照组,每组32只,雌雄不限。实验组生后即置于氧箱中,持续输入氧气,维持氧浓度为0.90(用测氧仪检测),CO2浓度<0.5%(用钠石灰吸收,Dapex气体分析仪检测),温度为25~27℃,湿度50%~70%(用变色硅胶吸收水蒸汽)。每天定时开箱0.5 h,添加水、饲料及更换垫料,并与对照组交换代母鼠,以避免因氧中毒而致喂养能力下降。对照组置于空气中,具体方法及控制因素同实验组[1]。

1.2.2 标本的收集:于实验后3、7、14、21 d分别从两组中随机抽取8只,用10%的水合氯醛麻醉后立即打开胸腔,分离肺组织。将左肺置于4%多聚甲醛中固定,石蜡包埋,常规制备5μm切片用于HE染色,右肺置于-80℃冰箱冻存,用于实时定量PCR检测和Western blot分析。

1.2.3 肺组织纤维化评分:按Ashcroft等人的方法于10倍光镜下进行双盲纤维化评分[2]。评分标准:0分为正常肺组织;1分为肺泡或细支气管壁少许纤维化,2~3分为中度纤维化而肺泡结构无改变;4~5分为有明确的肺泡结构改变(肺泡壁明显增厚),纤维束或纤维小结形成;6~7分为有严重肺泡结构改变和大片纤维化;8分为完全纤维化。

1.2.4 肺组织CDK2及P27蛋白表达检测:采用SP免疫组织化学方法。石蜡切片常规脱蜡至水,采用抗原热修复法,正常山羊血清封闭,兔抗大鼠CDK2单克隆抗体及小鼠抗大鼠P27单克隆抗体(1∶200)4℃过夜,生物素标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗体37℃30 min,链霉素抗生物素-过氧化物酶37℃10 min,DAB显色,镜下控制显色时间,苏木素复染,水化30 min,常规脱水,树胶封片。结果判定:应用美国Universal Imaging Porpomtion图像分析系统,应用Meta Morph软件分析图像平均灰度值,并用来表示CDK2及P27表达的强度,平均灰度值与蛋白表达水平呈反比。

1.2.5 肺组织CDK2及P27基因表达检测:实时定量PCR技术用TRIzol一步法提取肺组织RNA。采用SYBRGreenⅠ荧光染料嵌合法检测CDK2 mRNA及P27 mRNA。先构建目的基因(CDK2基因和P27基因)和管家基因(GAPDH)的RNA标准品,制作标准曲线,利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正,检测各组肺组织中CDK2及P27目的基因的相对表达量。CDK2 mRNA的相对表达量=CDK2基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数。P27 mRNA的相对表达量=P27基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数。校正结果以生理盐水对照组为1,其余组与之相比较。PCR反应体系的组成参照说明书进行。反应条件为逆转录反应37℃ 15 min,85℃ 5 s,PCR 扩增 95℃ 10 s,1 个循环,55 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40 个循环。CDK2、P27 和GAPDH 引物序列如下:CDK2-F 5′-CATCAAGCTGGCTGACTTTGGA-3;CDK2-R 5′-GTGGAGTAGTACT TGCGCCC AGAA-3′;P27-F 5’-TTGGTGGAC -CAAATGCCTGA-3’;P27-R5’-GCTCCACAGTGCCAGCA TTC-3’;GAPDH-F 5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′;GAPDH-R 5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′。CDK2产物片段 126 bp,P27产物片段 169 bp,GAPDH产物片段144 bp。

1.2.6 Western blot分析:取大约100 mg肺组织置于0.5 ml蛋白裂解液中,于冰上超声波粉碎机下将组织粉碎,匀浆于1 000 r/min,4℃,离心5 min,取上清即为蛋白提取物。采用BCA法对蛋白样品进行定量。用蒸馏水将蛋白样品调成相同浓度,加入相同体积上样缓冲液,沸水煮10 min进行蛋白变性。取50μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,浓缩胶电压90 V,分离胶电压110 V,90 min;电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上,电压80 V,1 h;脱脂奶粉封闭1 h,加入兔抗大鼠CDK2抗体和小鼠抗大鼠P27抗体(1∶1 000),4℃过夜;然后加入二抗室温孵育2 h,BCIP/NBT显色液显色,约10 min,蒸馏水终止反应。以β-actin作为内参.结果通过天能图像分析系统进行分析,CDK2蛋白含量=样本CDK2蛋白灰度值/同一样本β-actin灰度值,P27蛋白含量=样本P27蛋白灰度值/同一样本β-actin灰度值。

1.3 统计学分析

应用SPSS14.0软件进行数据处理,所有数据均以x±s表示,组间比较应用t检验,相关分析采用Spearman分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下各组肺组织纤维化评分比较

见表1。

2.2 免疫组化检测各组肺组织CDK2及P27蛋白表达

见表 2,图 1。

2.3 实时定量PCR检测各组肺组织CDK2及P27基因表达

见表 3,图 2。

2.4 肺组织CDK2、P27基因表达与肺组织纤维化评分的相关性

高氧暴露下新生鼠肺组织CDK2基因的表达与纤维化评分呈正相关:(r=0.702,P<0.05);P27 基因表达与纤维化评分呈负相关:(r=-0.765,P<0.05)。

表1 实验组和对照组肺组织纤维化评分(n,x±s)Tab.1 Lung fibrosis scores of control and experimental groups(n,x±s)

表2 实验组和对照组肺组织CDK2及P27蛋白表达的平均灰度值(x±s)Tab.2 Mean intensity of CDK2 and P27 protein of controland experimentalgroups(x ±s)

表3 实验组和对照组肺组织CDK2、P27基因表达(x±s)Tab.3 Relative expression of CDK2 and P27 genes in control and experimental groups(x ±s)

2.5 Western blot蛋白定量分析

各组在33 kDa处和27 kDa处可见特异性蛋白条带,对各条带进行灰度分析发现:对照组变化均不明显,实验组CDK2 3 d时与对照组无差异,7 d时表达升高,14 d 时明显升高(0.51±0.05),与对照 14 d相比(0.39±0.06),差异有统计学意义(P<0.05),21 d时达到高峰(0.64±0.08),与对照 21 d相比(0.40±0.06),差异有统计学意义(P<0.05);实验组 P27 3 d时与对照组无差异,7 d时表达开始开始降低,14 d时明显降低(0.48±0.07),与对照 14 d相比(0.60±0.06),差异有统计学意义(P<0.05),21 d时达到最低值(0.36±0.05),与对照 21 d相比(0.59±0.09),差异有统计学意义(P<0.05)(图 2)。

3 讨论

尽管高氧致早产儿CLD的发病机制尚未清楚,但其肺组织纤维化的最终病理结局已公认,有关其纤维化的发生机制认为与下列因素有关:(1)ECM合成及降解失衡,其中胶原的过度合成和沉积超过基质蛋白酶的降解能力在CLD的发生发展中发挥重要作用;(2)复杂的细胞作用,肺巨噬细胞、肺上皮细胞及肺间质成纤维细胞是研究的热点,其中肺成纤维细胞是公认的纤维化发生的效应细胞;(3)庞大的细胞因子网络,其中研究最多的就是可促进细胞增生和胶原蛋白合成的转化生长因子β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)。特别是其下游更具特异性的促纤维化而不影响其他生物学活性的新靶点成为近年研究的热点。

正常细胞增殖需经历G1、S、G2和M期4个时相,S期为DNA合成期,M期为有丝分裂期。期间存在多个检控点调节各时相间的转换。在所有检控点中,尤以G1→S最为重要。它通过接受细胞周期蛋白构成的网络调节系统作用,发挥细胞周期调控功能[3]。静止期细胞处于G0期,受到生长信号刺激进入G1期,准备DNA合成。此时,细胞周期蛋白(cyclin)表达上调,结合并激活相应的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase,CDK),二者的复合物使视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化,从而释放出重要的核转录因子(E2F),引起一系列与S期有关靶分子的表达。通过G1晚期的限制点后,细胞进入S期,此时发生复制。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinaseinhibitor,CDKI)发挥负性调控作用。

近年来,随着细胞周期调控机制的阐明,细胞周期调控因子在恶性肿瘤发病机制中的作用受到人们重视[4]。多种肿瘤组织及细胞内均发现CDK2及P27的异常表达[5]。研究发现,胆管癌细胞中CDK2呈高表达,与对照组相比有显著统计学差异[6]。Sui等[7]研究发现,P27在卵巢癌中的表达较卵巢良性和良恶交界性肿瘤中减少。也有研究发现,CDK2的表达与垂体腺瘤的侵袭性呈正相关,而P27的表达与垂体腺瘤的侵袭性呈负相关[8]。靶向CDK2的siRNA能抑制肝细胞生长因子诱导的HepG2细胞增殖[9]。病毒载体介导的P27过表达可以诱导体外肿瘤细胞周期停滞及凋亡[10]。

目前有关CDK2及P27异常表达对肺纤维化影响作用的研究报道较少。但有研究发现[11],正常大鼠肾脏有P27表达,其对肾脏细胞的增殖、分化、凋亡等有重要的调控作用,而在肾间质纤维化大鼠模型中P27的表达与纤维化程度呈明显负相关。血管平滑肌细胞异常增殖时CDK2蛋白表达上升[12]。说明CDK2高表达及P27低表达均与纤维化密切相关。在本实验中我们也发现,高氧致CLD新生鼠中,对照组随着日龄的增加,肺泡发育逐渐成熟,作为正常细胞周期活动的必要蛋白,CDK2及P27在对照组中呈阳性表达。实验组随着吸氧时间的延长,CDK2蛋白和基因的表达呈逐渐上升的趋势,14 d和21d时CDK2明显高于同时间对照组(P<0.05),其基因表达与纤维化程度呈正相关;P27蛋白和基因的表达呈逐渐下降的趋势。14 d和21 d时明显低于对照组(P<0.05),其基因表达与纤维化程度呈负相关。体外实验发现,体外培养人肺成纤维细胞增殖和表型转化时CDK2基因表达增加[13]。用结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)刺激体外培养肺成纤维细胞,细胞明显增殖,且P27表达下调[14]。体外培养的特发性肺纤维化患者的成纤维细胞中,P27表达明显低于正常人[15]。在本研究中,高氧后肺组织中CDK2表达上调及P27表达下调,提示细胞周期蛋白异常表达导致肺成纤维细胞过度增殖,这一机制可能在CLD肺纤维化发生中发挥极为重要的作用。在高氧致CLD中,TGF-β1是如何启动这一机制,而CDK2及P27又是如何发挥作用的有待进一步深入研究。

[1]富建华,薛辛东.慢性肺疾病早产鼠转化生长因子β1基因和蛋白动态表达及其对肺发育的抑制作用[J].中华儿科杂志,2005,43(6):463-465.

[2]Ashcroft T,Simpson JM,Timbrell V,et al.Simplemethod of estimatingseverityofpulmonaryfibrosisonanumericalscale[J].Clin Pathol,1988,41(4):467-470.

[3]Sullivan SM,Holyoak T.Enzymeswith lid-gated activesitesmust operate by an induced fit mechanism instead of conformational se1ection[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(37):13829-13834.

[4]Ivetac A,Mcammon JA.Elucidating the inhibition mechanism of HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors through muhicopymoleculardynamicssimulations[J].Mol Biol,2009,388(3):644-658.

[5]Corsino PE,Davis BJ,Norgaard PH,et al.Mammary tumors initiated by constitutive CDK2 activation contain an invasive basal-like component[J].Neoplasia,2008,10(11):1240-1252.

[6]胡逸林,张端莲.CDK2蛋白在胆管细胞癌中的表达及临床意义[J].华南国防医学杂志,2010,24(1):3-5.

[7]Sui L,Dong Y,Ohno M,et al.Implication of malignancy andprognosis of p27(kip1),cyclin E,and cdk2 expression in epithelial ovarian tumors[J].Gynecol Oncol,2001,83(1):56-63.

[8]郑安锡,霍钢,黄晓明,等.细胞周期相关蛋白cyclin E、CDK2和P27 在垂体腺瘤中的表达[J].Modern Med J,2009,37(3):179-183.

[9]Sugatani J,Osabe M,Kurosawa M,et al.Induction of UGT1A1 and CYP2B6 by an antimitogenic factor in HepG2 cells is mediated through suppression of cyclin-dependent kinase 2 activity:cell cycledependentexpression[J].Drug Metab Dispos,2010,38(1):177-186.

[10]Lee CT,Lee YJ,Kwon SY,et al.In vivo imaging of adenovirus lransduction and enhanced therapeutic effieacy of combination therapy with conditionally replicating adenovirus and adenovimsp27[J].Cancer Res,2006,66(1):372-377.

[11]孙剑,陶立坚,宁旺斌,等.P27和TGF-β在大鼠肾间质纤维化中的表达及关系[J].细胞与分子免疫学杂志,2008,24(8):808-813.

[12]Shimizu-Hirota R,Sasamura H,Kuroda M,et al.Extracellular matrix glycoprotein biglycan enhances vascular smooth muscle cell proliferation and migration[J].Circ Res,2004,94(8):1067-1074.

[13]Schuliga MJ,See I,Ong SC,et al.Fibrillar collagen clamps lung mesenchymal cells in a nonproliferative and noncontractile phenotype[J].JRespir Cell Mol Biol,2009,41(6):731-741.

[14]Wu SH,Wu XH,Lu C,et al.Lipoxin A4 inhibitsproliferation of human lung fibroblastsinduced by connective tissuegrowth factor[J].JRespir Cell Mol Biol,2006,34(1):65-72.

[15]Moodley YP,Scaffidi AK,Misso NL,et al.Fibroblasts isolated from normal lungs and those with idiopathic pulmonary fibrosis differ in interleukin-6/gp130-mediated cell signaling and proliferation[J].J Pathol,2003,163(1):345-354.

猜你喜欢

肺纤维化细胞周期灰度
我国研究人员探索肺纤维化治疗新策略
采用改进导重法的拓扑结构灰度单元过滤技术
遗传性T淋巴细胞免疫缺陷在百草枯所致肺纤维化中的作用
滇龙胆草对肺纤维化小鼠肺组织NF-κB和CTGF表达的影响
Bp-MRI灰度直方图在鉴别移行带前列腺癌与良性前列腺增生中的应用价值
硫酸高乌甲素对人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡与细胞周期的影响
知母皂苷AⅢ对白血病细胞HL-60增殖、凋亡和细胞周期的影响及机制探讨
基于最大加权投影求解的彩色图像灰度化对比度保留算法
NSCLC survivin表达特点及其与细胞周期的关系研究
慢性阻塞性肺疾病合并肺纤维化临床研究