楚秋霞，施巧婷，魏成斌，徐照学*，丁 岩

(1.河南省农业科学院 畜牧兽医研究所，河南 郑州 450008；2.郑州市动物园，河南 郑州 450000)

影响体细胞核移植效率的因素很多,供体细胞选择是核移植实验成功的基础和关键。本文参考近年来国内外在动物体细胞核移植技术方面的资料，从供体体细胞类型、细胞年龄、细胞传代及细胞周期对克隆效率的影响进行简要综述。

供体细胞；核移植；克隆效率

*通讯作者： 徐照学(1961-) ,男,陕西华县人,研究员，博士,硕导，主要从事动物胚胎工程研究。

自从1997年世界首例体细胞克隆绵羊多莉诞生以来,引起了世界各国的关注。接着小鼠、牛、山羊和猪等在多个物种中陆续获得成功。实践证明，利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的。因此许多研究人员致力于寻找合适的供核细胞进行核移植试验。目前核移植供体核来源广泛，种类繁多。大量研究结果表明，分化程度越低的细胞构建的重构胚发育潜力越高。但由于未分化和低分化细胞受多种因素的影响，因此不同制备途径获取的体细胞在做为核供体进行克隆过程中所获得的移植效率也不相同。因此研究人员尝试对体细胞进行多方面的试验以期望获得适合的供体细胞，提高重构胚的发育效率。

1 供体细胞的类型

不同类型供体细胞对核移植重构胚的构建效率不尽相同。Kato 等比较了颗粒细胞、输卵管上皮细胞和皮肤等组织来源的细胞后，认为颗粒细胞和输卵管上皮细胞是较适宜的供体类型[1]。杨素芳等在水牛研究中采用成体成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、胎儿皮肤细胞和卵巢颗粒细胞作为供体细胞来源用于核移植。结果显示, 来源于卵丘/ 颗粒细胞的重构胚,其融合率、卵裂率和囊胚发育率都高于其他类型细胞[2]。龚国春等的实验也证实，对于非转基因细胞，胎儿输卵管上皮细胞所得重构胚的囊胚发育率显著高于胎儿成纤维细胞、卵丘细胞、成体成纤维细胞[3,4]。对于转GFP基因的细胞，胎儿输卵管上皮细胞和卵丘细胞的重构胚囊胚发育率显著高于胎儿成纤维细胞和胎儿卵巢上皮细胞，而胎儿输卵管上皮细胞和卵丘细胞之间的差异不显著。通过转染试剂对不同来源的牛体细胞进行转染后用于核移植，发现胎儿成纤维细胞是最有效的转染细胞类型[5]。迄今已有胎儿、成体成纤维细胞、颗粒细胞等多种体细胞被用作核供体生产出克隆动物。是否所有组织的细胞都可用于克隆, 目前还不能得出系统的结论。通常研究人员认为颗粒细胞DNA 能被更有效的重新程序化，利于胚胎的重构。胎儿成纤维细胞便于基因修饰，这两种细胞常作为供体细胞。

2 供体细胞的年龄

供体细胞的年龄对克隆技术的适用范围至关重要。“多莉”羊的诞生为动物克隆技术的研究提供了希望。但随着多莉的成长, 很多问题也随之产生 ,如出现老化迹象等。研究证明 ,它的端粒长度与供体羊相似 ,然而端粒的长短又直接决定着动物个体寿命的长短[7],也就是说从它一出生它就已经6岁了。Kato 等在牛上出现类似的情况, 由于选用的是一头10岁的公牛做为供体，观察发现新生克隆小牛体表出现“皱纹”,骨结构与毛质都与供体牛相似[1]。供体细胞年龄在影响动物寿命的同时,对克隆效率的影响也是值得关注的。杨素芳等研究中发现成年耳部成纤维细胞的融合率、卵裂率和囊胚发育率显著低于胎儿成纤维细胞和胎儿皮肤细胞[2]。但也有研究认为，体细胞克隆胚胎的发育率与供体细胞动物的年龄无关。Hill等用同一基因型的成体成纤维细胞和胎儿成纤维细胞作供体。它们分别来自21岁龄婆罗门公牛(Barhmna)和由婆罗门公牛细胞克隆而来的40日龄的核移植胎儿。结果显示:以这二种供体细胞进行核移植, 它们的囊胚形成率相同[6]。目前，供体细胞年龄对重构胚的构建及后代的产生影响有多大, 还有待进一步的研究。

3 供体细胞的传代

在体细胞核移植研究中,人们一直研究体细胞在多少代时能获得理想的实验结果。多次传代后是否会影响基因丢失和基因突变，从而给供体细胞本身和重构胚体外培养带来负面影响。在山羊成纤维细胞核移植研究中，传代超过10代时，供体细胞和受体细胞的融合率明显下降，其可能是由于随着细胞传代次数的逐渐增加，供体细胞表面的微绒毛逐渐增加，进而限制其和受体细胞的进一步融合[7]。随着传代次数的增加，细胞的倍型也有所改变。以胎儿成纤维细胞、卵丘细胞和输卵管上皮细胞为供体进行猪核移植，研究发现3种不同类型细胞所构建的重构胚发育至囊胚的比例均明显高于传代7代以上的细胞[8]。然而，Kasinathan 等采用15岁牛的体细胞，传至10～15代，甚至 18 代的细胞用于体细胞核移植，并未影响核移植胚的发育潜力[9]。Arat等在克隆转基因牛的研究中发现，培养至第 15 代的细胞核移植后，其囊胚率高于培养至第10、第11、第13代的细胞[10]。以上说明核供体细胞在多次传代后也能够获得好的实验效果，目前对于这样的结果尚未作出合理的解释。人们怀疑造成这种克隆研究效率不同的原因可能是不同动物种类和细胞类型的差异造成，因为不同细胞有各自的独特性质,细胞自身的动力系统可能会随培养环境的改变而不同。在试验中通常选用培养10代之内的细胞做为核供体细胞。

4 供体细胞的周期

体外培养的细胞一般都呈快速生长状态，但细胞分裂是不同步的。在体细胞克隆过程中，供体细胞和受体细胞核质同步化(synchroniZation)是影响克隆效率的一个关键因素。研究人员常用GO/GI期的细胞做为核供体细胞[11-12]。处于 G1/G0 期的细胞, 因为DNA未开始复制, 其核为二倍体。Wilmut等利用G0/G1期的乳腺上皮细胞作为供体细胞获得体细胞克隆绵羊[13]。Kasinathan 等采用接触抑制法获得G0/G1做为核供体细胞获得体细胞克隆牛[9]。然而，Wakayama等研究小鼠克隆试验结果表明，M 期细胞做供体也能够获得克隆小鼠后代[14]。有研究人员利用非G0/G1期颗粒细胞和胎儿成纤维细胞做核供体也先后获得克隆牛和克隆小鼠。然而以上试验结果并不能完全证明克隆后代就是来源于M期的供体细胞，上述试验的供体细胞中，虽然M期细胞占主要比例，但是其中也含有一定比例的G0/G1期[15]。虽然有些试验利用M和G2期细胞作为供体细胞进行克隆研究，但是，目前比较统一的认识是采用 G0/G1 期细胞作为核供体可以获得较高的核移植效率。因此在实验中通常采用血清饥饿和接触抑制方法对供体细胞进行周期干预，获得高比例G0/G1 期的细胞，提供充足的供体细胞。

结束语：

体细胞核移植技术的出现不仅推动了早期胚胎发育机制的进一步研究，也为转基因动物的研制提供了新的思路,以基因组定点修饰的体细胞为供体细胞，利用体细胞核移植技术生产转基因动物成为可能，从而达到改良以及传播优良品种。

供体细胞选择和制备操作环节多、技术难度大，任意环节都会影响克隆效率。本文从供体细胞的不同选择方面对重构胚的构建及发育效率做了简单综述，它是核移植多项环节中最基础和关键的部分，也是影响克隆效率的主要因素之一。因此，为了获得高效率克隆，我们应根据现有的实验条件，从体细胞克隆的整体效率出发，优化体细胞克隆中的各项环节，以期提高克隆效率，促进体细胞克隆动物的获得。

[1] Kato Y，Tani T，Sotomaru Y，et al.Eighte alves cloned from somatic cells of a single adult.Science,1998,282:2095-2098.

[2] 杨素芳, 石德顺, 韩 杰，等。供体核种类对水牛核移植效果的影响[J] . 广西农业生物科学, 2004, 23(3) : 233-237.

[3] 龚国春， 戴蕴平，朱化彬，王海平，等。供体细胞类型对体细胞克隆牛生产效率的影响[ J] .中国科学 C 辑 生命科学 2004, 34 (3): 257-262.

[4] 龚国春，戴蕴平，樊宝良，等。以不同类型的基因细胞为核供体生产牛的转基因克隆胚胎[ J] .2003，33(6)：232-237.

[5] Lee S L， Ock S A， Yoo J G， et al. Efficiency of gene transfection into donor cells for nuclear transfer of bovine embryos[J]．Mol ReprodDev,2005,72(2):191-200．

[6] Hill J R, Winger Q A, Long C R. Development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived from adult and fetal cells. Biology Reproduction, 2000, 62(5): 1135-1140.

[7] 王玉阁， 邹贤刚， 成国祥， 等． 由胎儿成纤维细胞而来的克隆山羊[J]． 科学通报，1999，44(21):2319-2323．

[8] Zhang Y H，Song E S，Kim E S，et al. Effects of donor cell passage，size and type on development of porcine embryos derived from somat-ic cell nuclear transfer[J]．Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2009，22(2):194-200．

[9] Kasinathan P， Knott J G， Moreira P N， et al． Effect of fibroblast do-nor cell age and cell cycle on development of bovine nuclear transfer embryos in vitro[J]．Biol Reprod，2001， 64(5) :1487 -1493．

[10] Arat S， Rzucidlo S J， Gibbons J， et al． Production of transgenic bo-vine embryos by transfer of transfected granulosa cells into enuclea-ted oocytes[J]．Mol Reprod Dev， 2001， 60 (1) :20-26．

[11] Gomez M C， Jenkins J A， Giraldo A， et al． Nuclear transfer of syn-chronized african wild cat somatic cells into enucleated domestic catoocytes[J]． Biol Reprod，2003， 69(3):1032-1041．

[12] Liu C T， Yu K C， Ju J C．Cell cycle stage analysis of rabbit foetal fi-broblasts and cumulus cells[J]．Reprod Domest Anim，2004，39(6):385-390．

[13] Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells [J]. Cloning Stem Cells.2007,9(1):3-7.

[14] Wakayama T, Rodriguez I, Perry AC, et al.Mice cloned from embryonic stem cells [J]. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999,96:14984-14989.

[15] Cibelli JB, Stice SL, Golueke P, et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts [J].Science.1998,280:1256-1261.