赵广西　刘志梅

摘 要：目的：建立高效液相色谱质谱联用技术定量检测动物源性食品中的N-二甲基亚硝胺。方法：样品前处理粉碎后经乙腈提取，低温离心除去油脂，QuEChERS净化，采用多反应监测模式测定。结果：N-二甲基亚硝胺校准曲线在2.0～200.0 ng·mL-1线性关系良好，相关系数为0.998 5，方法检出限和定量限分别为0.5 μg·kg-1和3.0 μg·kg-1，回收率为86.8%～90.8%，相对标准偏差在2.2%～3.1%。结论：该方法取样量少，试剂消耗量少，提取和净化流程简便，定性和定量准确度好，可用于检测动源性食品中N-二甲基亚硝胺。

关键词：高效液相色谱-质谱联用技术；QuEChERS；N-二甲基亚硝胺；多重反应监测

Determination of N-Dimethylnitrosamine in Food of Animal Origin by QuEChERS Combined with LC-MS/MS

ZHAO Guangxi1， LIU Zhimei2

（1.Qinhuangdao Municipal Food and Drug Inspection Center， Qinhuangdao 066000， China; 2.Qinhuangdao Administration of Market Regulation， Qinhuangdao 066000， China）

Abstract： Objective： To establish a high performance liquid chromatography-mass spectrometry method for the quantitative determination of N-dimethylnitrosamine in animal derived food. Method： The sample was extracted by acetonitrile after pretreatment and grinding， and the oil was removed by low temperature centrifugation， purified by QuEChERS， and determined by multi-reaction monitoring mode. Result： The calibration curve of N-dimethylnitrosamine had a good linear relationship in the range of 2.0～200.0 ng·mL-1， and the correlation coefficient was 0.998 5. The detection limit and quantitative limit of the method were 0.5 μg·kg-1 and 3.0 μg·kg-1， respectively. The recovery rate was 86.8%～90.8%， and the relative standard deviation was 2.2%～3.1%. Conclusion： This method has the advantages of less sampling， less reagent consumption， simple extraction and purification process， good qualitative and quantitative accuracy， and can be used to detect N-dimethylnitrosamine in animal-derived food.

Keywords： high performance liquid chromatography-mass spectrometry; QuEChERS; N-dimethylnitrosamine; multiple reaction monitoring

肉、魚等食品中富含蛋白质和脂肪，在煎、炸、烤等热处理过程中会产生较多的胺类化合物，易与亚硝酸盐反应生成亚硝胺类化合物，其中主要是N-亚硝基二甲胺。N-亚硝胺类化合物具有基因毒性，能够直接或间接损伤细胞DNA。实验证明，该类化合物有强致癌性，小剂量长期接触或较大剂量冲击都可引发癌症[1-4]。国际癌症研究机构在1987年将亚硝胺列为2A级致癌物。多国对食品中N-亚硝胺类化合物限量进行了严格的规定，美国农业部规定食品中总挥发性亚硝胺限量为10 μg·kg-1；我国《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2022）规定，肉制品中N-二甲基亚硝胺限量为3.0 μg·kg-1，水产品中限量为4.0 μg·kg-1[5-6]。

亚硝胺在食品中含量极微，一般在μg·kg-1水平，且检测过程中易受复杂背景基质的干扰。前处理是整个分析检测过程的关键和难点环节，影响分析的各项指标。样品前处理技术主要有固相萃取、固相微萃取、凝胶渗透色谱以及QuEChERS等技术[7-8]。亚硝胺检测方法主要有气相色谱-热能分析联用法、气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法。其中，液相色谱-串联质谱法因具有高灵敏度和普适性较好的特点，被广泛应用于食品中亚硝胺的检测[9-10]。

本研究建立了一种基于大气压化学电离源的高效液相色谱-质谱联用法测定动物源性食品中N-二甲基亚硝胺的方法，该方法操作简单、灵敏度高，可用于普通实验室对不同动物源性食品中亚硝胺的快速检测，为食品安全提供实际参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC 20A液相色谱仪（岛津）；AB5500三重四极杆质谱（AB）；氮吹仪（安谱）；高速冷冻离心机（Sigma）；高速万能粉碎机（泰斯特）。

甲醇（色谱纯，TEDIA）；乙腈（色谱纯，TEDIA）；甲酸（色谱纯，Sigma）；实验用水为超纯水（Millipore）；N-二甲基亞硝胺标准液（CAS：62-75-9，浓度1 000 μg·mL-1，坛墨质检-标准物质中心）。

1.2 样品前处理

称取5 g（精确到0.01 g）干制品于50 mL离心管中（鲜样品称取10 g，精确到0.01g），加入10 mL水，振荡10 min，加入乙腈5 mL，涡旋振荡3 min，于-18 ℃冷冻60 min，加入5 g硫酸镁和2 g氯化钠，涡旋振荡2 min，2 ℃、9 000 r·min-1冷冻离心10 min，移取上清液。

称取150 mg HLB，100 mg无水硫酸镁粉末于15 mL离心管中，加入上清液涡旋振荡2 min，置于冷冻离心机，9 000 r·min-1、2 ℃离心5 min。取2 mL上清液，转入试管中，控制氮吹温度在15 ℃低速氮吹至0.9 mL，准确定容至1.0 mL，0.25 μm滤膜过滤，进行检测。

1.3 色谱/质谱条件

色谱条件：Waters UPLC BEH C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以0.1%甲酸的水溶液（A）、0.1%甲酸的甲醇溶液（B）进行梯度洗脱；流速：0.4 mL·min-1；柱温：40 ℃；多重反应监测模式下正离子模式定量分析。梯度洗脱程序：0.0～3.0 min，10%B；3.0～6.0 min，95%B；6.0～7.0 min，95%B；7.0～9.0 min，10%B；9.0～10.0 min，10%B。具体质谱条件见表1。

1.4 标准工作溶液配制

准确移取N-二甲基亚硝胺标准品溶液100 μL于10 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容，得到浓度为10 μg·mL-1的标准溶液；再次用二氯甲烷稀释成浓度分别为2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1及200 ng·mL-1的N-二甲基亚硝胺标准工作溶液。

2 结果与分析

2.1 条件优化

2.1.1 提取液的选择

提取溶剂对检测结果有较大影响。在空白样品中加入100 ng N-二甲基亚硝胺，分别考察乙腈、二氯甲烷、正己烷3种提取溶剂对空白样品提取效果的影响。试验重复3次。结果表明，乙腈的提取效果最佳；其次是二氯甲烷；正己烷的提取效果较差，难以满足定量要求。

2.1.2 氮吹水浴温度的选择

N-二甲基亚硝胺的相对分子质量较小、性质不稳定，氮吹水浴温度直接影响目标化合物的回收率。在加标量为20 ?g·kg-1的条件下，采用加标回收试验的方式，对10 ℃、15 ℃、20 ℃、30 ℃4个温度条件进行考察。由表2可知，当氮吹水浴温度为15 ℃时，氮吹的时间较短，回收率最大。当氮吹水浴温度小于15 ℃时，回收率虽然较大，但氮吹时间过长；当氮吹水浴温度大于15 ℃时，随着水浴温度的升高，目标化合物的挥发较快，导致回收率下降。

2.1.3 仪器条件的优化

（1）洗脱条件的优化。为实现目标物与其他干扰物质的良好分离，对仪器流动相洗脱条件进行了优化。采用某空白加标样品作为测试样，分别考察不同洗脱条件（0.1%甲酸水溶液 - 甲醇、0.1%甲酸水溶液-0.1% 甲酸甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-乙腈）下的洗脱效果。结果表明，0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇为流动相时，分离度良好，洗脱效率高。

（2）色谱柱的优化。对Waters XBridge C18、Waters Atlantis T3、Waters UPLC BEH C18 3种色谱柱的分离效果进行比较。结果显示，当采用Waters XBridge C18柱时，目标化合物分离好，峰形尖锐，保留时间适中，能满足定量检测要求。因此，最终选择Waters XBridge C18色谱柱。N-二甲基亚硝胺标准溶液液相色谱-质谱/质谱多重反应监测图如图1所示。

2.2 方法学考察

以目标化合物峰面积比为纵坐标，质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果显示，标准曲线线性范围为2.0～200.0 ng·mL-1，线性回归方程为y=7 575.77x+6 345.784 3，相关系数为0.998 5，表明标准曲线线性关系良好。信噪比为3时，检出限为0.5 μg·kg-1；信噪比为10时，定量限为3.0 μg·kg-1。

2.3 加标回收试验

选取熏煮火腿作为样品，添加N-二甲基亚硝胺标准品，设置5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1、20.0 μg·kg-1 3个加标水平，每个水平6个平行，按1.2处理后进行测定，分别计算加标回收率与相对标准偏差。由表3可知，不同加标浓度下，N-二甲基亚硝胺的平均回收率为86.8%～90.8%，相对标准偏差为2.2%～3.1%。结果表明，该方法准确高，稳定性好。

2.4 实际样品分析

采用本方法对本地区2种不同来源的肉制品（香肠、腌鱼），共16个样品进行分析。部分样品中检出N-二甲基亚硝胺留，含量为0～16.4 μg·kg-1，表明样品中有一定量的N-二甲基亚硝胺残留。

3 结论

本研究建立了一种QuEChERS结合液相色谱-质谱联用法筛查、定性确证与定量动物源食品中N- 二甲基亚硝胺的方法。本方法在2.0～200.0 ng·mL-1具有良好的线性关系，检出限为0.5 μg·kg-1，定量限为3.0 μg·kg-1，回收率在86.8%～90.8%，优化了前处理条件，省去了蒸馏、萃取、旋蒸等复杂的前处理步骤，简化了提取和净化过程，缩短了实验时间，方法简单高效，为N-二甲基亚硝胺测定提供了一种新的可靠的方法。

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作者简介：赵广西（1979—），男，河北秦皇岛人，硕士，副高级工程师。研究方向：食品安全检测。