粟有志+李芳+赵光跃+黄志强+雷红琴+李艳美+陆平

摘 要 建立了高效液相色谱.串联质谱法（HPLC.MS/MS）测定植物源食品中环磺酮残留量的分析方法。样品经改进的QuEChERS方法一步完成萃取净化，经酸化乙腈（含0.1% （V/V）甲酸的乙腈）提取，经石墨化碳黑（GCB）净化，提取液经离心后直接过膜上机检测。HPLC.MS/MS方法以0.1%（V/V）甲酸.乙腈为流动相，在0.25 mL/min流速下梯度洗脱，采用C 18色谱柱进行液相色谱分离，电喷雾正离子电离（ESI+），多重反应监测模式（MRM）检测，基质匹配外标法进行定量分析。结果表明，在10种基质（玉米、大米、小麦、葡萄、苹果、葡萄干、枸杞、西红柿、黄瓜、白菜）中，环磺酮在0.5～100.0 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.996； 方法定量限（S/N≥10）为1.0 μg/kg； 在1.0， 2.0和10.0 μg/kg添加水平下，环磺酮的平均回收率为82.0%～111.8%，相对标准偏差为3.0%～14.9%。本方法高效快捷，灵敏度、准确度和精密度均符合农药残留检测要求。

关键词 环磺酮； 植物源食品； 高效液相色谱.串联质谱

1 引 言

环磺酮（Tembotrione）是由拜耳公司2007年研制的三酮类除草剂，商品名为Laudis，化学名：2.{2.氯.4.（甲磺酰基）.3.[（2，2，2.三氟乙氧基）甲基]苯甲酰基}.1，3.环己二酮，化学结构式如图1所示。其具有广谱、作用快速的特性，主要防治玉米田大多数阔叶与禾本科杂草，如藜、苋、苘麻、稗、狗尾草、马唐以及抗草甘膦、麦草畏杂草，目前已在奥地利、法国、巴西和美国等国家得到广泛使用[1，2]。环磺酮属于低毒农药，在动物组织中积累的风险较低，不会对DNA造成明显损伤[3]。加拿大制定其在甜玉米的残留限量为0.01 mg/kg[4]，但当前尚无食品中环磺酮残留的检测标准方法。针对环磺酮在我国农业生产中大量使用的预期，以及国外可能的“技术性壁垒”，建立食品中环磺酮残留的分析方法具有重要的意义。本研究建立了玉米、大米、西红柿等植物源性食品中环磺酮的检测方法，可为植物源性食品中环磺酮的检测标准方法的建立提供参考依据。

关于环磺酮检测方法的报道较少，仅见高效液相色谱（HPLC）法[5，6]和超高效液相色谱.飞行时间质谱（UHPLC.TOFMS）法[7]。Melo等[5]建立了环磺酮在土豆中的HPLC法，Hanna Barchanskal等[6]利用HPLC研究了环磺酮在土壤和沉积物中的降解规律。Pérez.Ortega1等[7]。利用UHPLC.TOFMS建立了包括环磺酮在内的350种农药的筛查方法。但HPLC法一般检出限较高、选择性较差、抗基质干扰能力较弱； UHPLC.TOFMS虽然在定性方面优势突出，但其检出限和定量准确性一般均不如液相色谱.串联四级杆质谱。

目前，农药残留分析前处理较常用的方法有固相提取（SPE）[8]、加速溶剂提取（ASE）[9]、凝胶渗透色谱法（GPC）[10] 和超声波辅助提取（USE）[11]等，但这些方法操作繁琐，费时费力，甚至需要某些特殊的设备。QuEChERS是一种快速、简单、廉价、高效、耐用、安全的样品前处理方法，已广泛用于食品中农药残留的检测[12～15]。本研究采用改进的QuEChERS方法，结合高效液相色谱.串联四级杆质谱仪，建立了植物源食品中环磺酮的分析方法。本方法操作简便快捷，精密度和回收率较好，适于植物源食品中环磺酮的定性与定量分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱.6460A型串联质谱仪（Agilent公司）； Sigma3.18K台式冷冻离心机（Sigma公司）； EYELA MMV.1000W振荡器（东京理化公司）； GM 200刀式混合研磨仪（Retsch公司）； T18基本型均质器（IKA公司）； N.EVAP.112水浴氮吹仪（Organomation公司）； MiIIi.Q Advangtage A10 超纯水系统（Millipore公司）； MS3型涡旋振荡器（IKA公司）。

环磺酮标准品（纯度为99%，Dr. Ehrenstorfer公司）； 乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙酸乙酯、正己烷（色谱纯，Merck公司）； 实验用水为超纯水（符合GB/T 6682.2008一级水要求）； 石墨化炭黑（GCB）、酸性氧化铝（ALA）和C 18、氨基（NH2）粉（Agilent公司）； 乙二胺.N.丙基硅烷（PSA）粒径40～60 μm、苯磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯（PCX）粒径40～60 μm、聚苯乙烯/二乙烯苯（PEP）粒径70～90 μm（Agela公司）； 分析样品为实验室送检和市售样品。

2.2 标准溶液的配制

标准储备溶液：准确称取标准品10 mg（精确至0.0001 g），用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为1000 mg/L的标准储备液，于储存4℃备用。

基质匹配标准曲线的配制：准确称取5.0 g样品（精确到0.01 g）按照2.3和2.4节条件进行前处理及仪器分析，当环磺酮的定性与定量离子信噪比<3时，样品确定为空白基质； 空白基质按照2.3节条件前处理，获得基质空白提取液，逐步用基质空白提取液将标准储备液稀释相应的工作浓度。

2.4 HPLC.MS/MS 条件

液相色谱条件：色谱柱为JADE.PAK CB.C 18柱 （100 mm×2.1 mm， 3 μm， Techway公司）； 柱温为30℃； 进样量为10.0 μL。流动相A为0.1%甲酸溶液， B为乙腈， 流速为0.25 mL/min， 梯度洗脱。洗脱程序如下：0～0.5 min， 10% B相； 0.5～1.5 min， 10%～65% B； 1.5～4.5 min， 65%～95% B； 4.5～5.5 min， 95% B相； 5.51～10 min， 10% B。

质谱条件：电喷雾正离子源模式（ESI+）； 多重反应监测（MRM）； 干燥气温度300℃； 干燥气流量10.0 L/min； 鞘气温度250℃； 鞘气流速9.0 L/min， 毛细管电压4 kV； 碎裂电压140 V； 驻留时间50 ms； 监测离子对分别为m/z 441.1>341.0， m/z 441.1>262.0， 碰撞能量分别为4和32 eV， 其中m/z 441.1>341.0为定量离子对。

3 结果与讨论

3.1 仪器条件的优化

配制1.0 mg/L环磺酮标准溶液， 分别采用电喷雾正离子模式（ESI+）和负离子模式（ESI）对其进行母离子扫描。结果表明， 环磺酮较适合于ESI+， 其准分子离子峰[M+H]+为m/z 441.1。进一步对子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行优化， 获得环磺酮二级质谱全扫描图见图2。参照欧盟指令657/2002/EEC 决议中有关规定， 本研究选择离子丰度最高、基质干扰最小的两个离子对作为特征离子对， 其中信号较大的离子对作为定量离子。最终确定环磺酮的特征离子对为m/z 441.1>341.0和m/z 441.1>262.0， 其中m/z 441.1>314.0为定量离子对。

采用电喷雾正离子模式（ESI+）分析样品时， 在流动相中加入微量的甲酸可提供目标化合物离子化所需要的H+， 微量的乙酸铵可以减少[M+Na]+离子的形成， 从而提高监测离子的灵敏度。本研究比较不同浓度的甲酸、乙酸铵、甲酸.乙酸铵溶液、纯水所组成的无机相（A相）， 乙腈、甲醇组成的有机相（B相）。通过A相与B相的组合比较分析发现， 0.1%甲酸（A）.乙腈（B）为流动相时， 环磺酮的离子化效率最佳。进一步确定A相和B相的比例， 结果如图3所示， 当A∶B为1∶9， 2∶8和3∶7时， 环磺酮在色谱柱上几乎不保留， 样品基质干扰强烈， 监测离子对信号较弱； 当A：B为4∶6和5∶5时， 环磺酮的基质干扰相对较小， 环磺酮的峰形有所改善， 但相对于梯度洗脱， 两者的峰宽较大、峰形较差。故本研究选择2.4节所述的梯度洗脱程序。

环磺酮的基质效应。结果表明， 酸化乙腈提取时， 环磺酮的基质干扰相对较小， 故选择酸化乙腈作为提取剂。同时还考察了不加水浸泡枸杞样品时， 酸化乙腈对环磺酮的提取效果。结果表明， 环磺酮的回收率为85.5%， 低于浸泡时的提取效率。

QuEChERS方法净化样品时， 常用PSA去除糖、有机酸和脂肪酸等干扰物， GCB除去叶绿素、类胡萝卜素等色素化合物， C 18除去脂肪和脂类等非极性有机物。以富含色素、糖分的枸杞为分析样品， 比较了PSA， C 18， PCX， PEP， NH2， ALA， GCB 7种吸附剂用量均为100 mg时对样品的净化效果。结果表明， 7种吸附剂净化时， 环磺酮的回收率均在87%～106%， 均能满足检测方法学要求； 进一步比较环磺酮的基质效应发现， GCB净化时， 样品的基质干扰相对较小。同时GCB净化后， 样品提取液均较为清澈。故本研究最终GCB净化样品。

比较了GCB用量为10， 25， 50， 75， 100， 150和200 mg时环磺酮的回收率和基质效应。结果表明， GCB用量为10 mg净化时， 用量过少， 环磺酮的基质干扰相对较大， 提取液呈浅黄色； GCB用量为为25～200 mg时， 环磺酮的回收率和基质效应无明显差别， 提取液均较清澈； 考虑经济成本， 本研究最终选择25 mg GCB净化样品。经25 mg GCB净化的空白枸杞、空白枸杞加标样品的色谱图见图5。

QuEChERS方法前处理样品时， 通常在提取液中加入适量无水MgSO4， 以达到吸附提取液中的水分或盐析的效果。但研究发现， 加入MgSO4后， 环磺酮的响应信号下降， 可能由于MgSO4增加了提取液中离子浓度， 从而影响环磺酮离子化， 故本研究不使用MgSO4。

3.3 基质效应、标准曲线、检出限和定量限

绘制溶剂标准溶液线性曲线和基质匹配标准溶液线性曲线， 计算和评价方法基质效应。基质效应系数以η表示：η= （基质匹配标准曲线的斜率-溶剂标准曲线的斜率）/溶剂标准曲线的斜率。若|η|<10%， 说明无明显基质效应； 反之， 则说明具有明显基质增强或减弱效应[16]。空白样品按照2.3节方法处理， 获得空白基质提取液， 逐级用空白基质提取液稀释标准储备液稀释至0.5， 1， 2， 5， 10， 50和100 ng/mL， 获得基质匹配标准曲线溶液； 同时用乙腈稀释标准储备液稀释至0.5， 1， 2， 5， 10， 50和100 ng/mL， 获得溶剂标准曲线溶液。由表1可知， 样品基质对环磺酮均有减弱效应， 部分样品基质效应明显， 不可忽略。以峰面积（y）对农药的质量浓度（x）作线性回归， 环磺酮在0.5～100 ng/mL范围内， 线性关系良好（相关系数均大于0.996）。环磺酮的线性方程详见表1。用空白基质提取液逐级稀释标准储备溶液， 以信噪比S/N≥3和S/N≥10计算方法检出限和定量限， 环磺酮的方法检出限为0.3 μg/kg， 定量限为1.0 μg/kg。Melo等[5]建立的土豆中环磺酮的HPLC法， 检出限为4.1 μg/kg； Barchanskal[6]建立的土壤和沉积物中环磺酮的HPLC法， 检出限分别为24和15 μg/kg； Pérez.Ortega等[7]建立的果酱中环磺酮残留的UHPLC.TOFMS法， 检出限为2.9 μg/kg； 故本方法的检出限明显优于上述文献方法。

3.4 方法的准确度和精密度

选择玉米、大米、小麦、葡萄、苹果、葡萄干、枸杞、西红柿、黄瓜和白菜空白样品， 以1.0， 2.0和10.0 μg/kg（即定量限、中间浓度、加拿大最高残留限量）为加标水平， 进行回收率实验。所有样品添加标准溶液后， 静置30 min， 待农残被样品充分吸收后， 按照2.3和2.4节条件进行前处理和测定， 每个水平重复6次。由表1可知：环磺酮的平均回收率为82.0%～111.8%， 相对标准偏差为3.0%～14.9%。

3.5 样品测定

利用本方法对市售的10种植物源性食品（玉米、大米、小麦、葡萄、苹果、葡萄干、枸杞、西红柿、黄瓜、白菜）共计50余份样品进行环磺酮残留量监测。结果表明， 样品中环磺酮的含量未检出。

4 结 论

本研究以酸化乙腈为提取剂， 样品经石墨化碳黑（GCB）吸附剂净化， 通过色谱和质谱条件的优化， 建立了植物源食品中环磺酮残留的HPLC.MS/MS检测方法。本方法简便快捷、灵敏度高、实用性强， 符合残留检测的相关要求， 适用于植物源食品中环磺酮残留量的快速检测。

References

1 HUA Nai.Zhen. World Pesticides， 2015， 37（6）： 7-13

华乃震. 世界农药， 2015， 37（6）： 7-13

2 SU Shao.Quan， TENG Chun.Hong. Modernizing Agriculture， 2014， 4： 1-2

苏少泉， 滕春红. 现代化农业， 2014， 4： 1-2

3 unec S， Kauba V， Pavicic I， Marjanovic A M， Taribad B， MiliC M， Kopjarb N， Pizentd A， Vrdoljaka A L， Rozgajb R， eljei.a D. Food Chem. Toxicol.， 2016， 94： 64-74

4 http：//www.hc.sc.gc.ca/cps.spc/pest/part/consultations/pmrl2015.20/pmrl2015.20.eng.php

5 Melo A， Mansilha C， Pinho O， Ferreira I. Food Anal. Methods， 2013， 6（2）： 559-568

6 Barchanska H， Kluza A， Krajczewska K， Maj J. J. Soil. Sediment.， 2016， 16（1）： 125-133

7 Pérez.Ortega P， Lara.Ortega F J， García.Reyes J F， Beneito.Cambra M， Gilbert.López B， Martos N R， Molina.Díaz A. Food Anal. Methods， 2016， 9（7）： 1939-1957

8 SU You.Zhi， LI Fang， LI Yan.Mei， LEI Hong.Qin， LUO Qiong， LIU Xu.Bin. Chinese J. Anal. Lab， 2015， 34（4）： 433-441

粟有志， 李 芳， 李艳美， 雷红琴， 罗 琼， 刘绪斌. 分析试验室， 2015， 34（4）： 433-441

9 Kadir H A， Abas F， Zakaria O， Ismail I S， Lajis N H. Anal. Methods， 2015， 7： 3141-3147

10 Qian M R， Zhang H， Wu L Q， Jin N， Wang J M， Jiang K Z. Food Chem.， 2015， 166： 23-28

11 Flores.Ramírez R， Medellín.Garibay S E， Castillo C G， Ilizaliturri.Hernández C A， Zuki.Orozco B A， Batres.Esquivel L， Díaz.Barriga F. Bull. Environ. Contam. Toxicol.， 2015， 95（2）： 207-214

12 Guedes J A C， de Oliveira Silva R， Lima C G， Milhome M A L， Nascimento R F D. Food Chem.， 2016， 199： 380-386

13 Rizzetti T M， Kemmerich M， Martins M L， Prestes O D， Adaime M B， Zanella R. Food Chem.， 2016， 196： 25-33

14 ZHANG Ai.Zhi， WANG Quan.Lin， CAO Li.Li， LI Yu， SHEN Hao， SHEN Jian， ZHANG Shu.Fen， MAN Zheng.Yin. Chinese Journal of Chromatography， 2016， 34（2）： 158-164

张爱芝， 王全林， 曹丽丽， 李 誉， 沈 昊， 沈 坚， 张书芬， 满正印. 色谱， 2016， 34（2）： 158-164

15 RUAN Hua， RONG Wei.Guang， SONG Ning.Hui， JI Wen.Liang， LIU Hua.Liang， MA Yong.Jian. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（8）： 1110-1116

阮 华， 荣维广， 宋宁慧， 吉文亮， 刘华良， 马永建. 分析化学， 2014， 42（8）： 1110-1116

16 DONG Mao.Feng， BAI Bing， TANG Hong.Xia， WANG Wei.Min， ZHAO Zhi.Hui， HAN Zheng， SONG Wei.Guo. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（5）： 663-668

董茂锋， 白 冰， 唐红霞， 王伟民， 赵志辉， 韩 铮， 宋卫国. 分析化学， 2015， 43（5）： 663-668

Abstract A method for determination of tembotrione in vegetative foods using high performance liquid chromatography.tandem mass spectrometry （HPLC.MS/MS） was developed. The sample was pretreated using modified QuEChERS （quick， easy， cheap， effective， rigged and safe） method in which the extraction and clean.up steps were completed in one procedure. The sample was extracted with acidic acetonitrile （containing 0.1% formic acid）， and cleaned up by graphitized carbon black （GCB）， and then the extracting solution was centrifuged and filtrated before detection. The HPLC.MS/MS method was performed on a C 18 column with gradient elution of acetonitrile and 0.1% formic acid at a flow rate of 0.25 mL/min. The mass spectrometric analysis was carried out with electrospray positive ion source （ESI+）， and multiple reaction monitoring mode （MRM）. The matrix.matched external standard method was used for quantification. The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.5-100 ng/mL with the correlation coefficients larger than 0.996， the limits of quantification （LOQ， S/N≥10） were 1.0 μg/kg in ten different matrix （corn， rice， wheat， grape， apple， raisin， Chinese wolfberry， tomato， cucumber， cabbage）. The mean recovery of tembotrione was 82.0%-111.8% and the relative deviation （RSD） was 3.0%-14.9% at 1.0， 2.0 and 10.0 μg/kg with three spiked levels. The method is highly effective and suitable for the monitoring of pesticide residue analysis.

Keywords Tembotrione； Vegetative foods； High performance liquid chromatography.tandem mass spectrometry