水产品中组胺快速检测的方法研究

2024-04-15汪开银熊丽莎陈斌黄丹萍聂小林熊晓辉

食品安全导刊·中旬刊 2024年1期

汪开银　熊丽莎　陈斌　黄丹萍　聂小林　熊晓辉

摘要：目的：建立水产品中组胺快速检测的方法，并进行方法学验证。方法：本研究以偶氮试剂法-比色卡法作为水产品中组胺的快速检测手段。样品中的组胺经提取后，通过正戊醇萃取净化，再与偶氮试剂反应生成橙色化合物，其溶液颜色的深浅在一定范围内与样品中组胺的含量呈正相关，通过组胺标准色阶卡进行目视比色，对样品中组胺进行定性判定。结果：以鲈鱼、秋刀鱼、罗氏虾作为空白基质的检出限为200 mg·kg-1，灵敏度和特异性为100%、假阴性率和假阳性率为0%。结论：该方法快速准确，灵敏度高，适用于水产品中组胺的快速检测。

关键词：组胺；水产品；方法学验证；快速检测

Research on Rapid Detection of Histamine in Aquatic Products

WANG Kaiyin1， XIONG Lisha2*， CHEN Bin1， HUANG Danping1， NIE Xiaolin1， XIONG Xiaohui3

（1.National Light Industry Food Quality Supervision and Inspection in Nanjing， Nanjing 211800， China; 2.Jiangsu Association for Food Production Safety， Nanjing 211816， China; 3.Nanjing Tech University， Nanjing 211800， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid method for detecting histamine in aquatic products and validate it through methodological validation. Method： This study used the azo reagent colorimetric card method as a rapid detection method for histamine in aquatic products. After extraction， histamine in the sample is purified by n-pentanol extraction， and then reacts with azo reagents to generate orange compounds. The color depth of the solution is positively correlated with the content of histamine in the sample within a certain range. The histamine in the sample is qualitatively determined by visual colorimetry using the histamine standard color scale card. Result： The detection limit using sea bass， saury， and shrimp as blank matrices was 200 mg·kg-1， with a sensitivity and specificity of 100% and a false negative and false positive rate of 0%. Conclusion： This method is fast， accurate， highly sensitive， and suitable for the rapid detection of histamine in aquatic products.

Keywords： histamine; aquatic products; methodological validation; rapid detection

組胺是一种生物碱，广泛存在于动植物体内。水产品中的组胺是机体在腐败过程中由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的[1-5]。所以，水产品尤其是一些青皮红肉鱼类，如秋刀鱼、沙丁油鱼、鲣鱼和金枪鱼等，长时间放置或发生腐败都容易产生组胺。组胺是所有生物胺中对人体健康影响最大的物质，过量摄入会导致头痛、头晕、心跳加快、皮肤瘙痒、呼吸困难等症状，甚至可能引起过敏性食物中毒[6-9]。所以，组胺是评价水产品特别是青皮红肉鱼类质量的重要指标，并且可以根据鱼肉中组胺含量，监测水产品在生产和运输过程中的质量变化。有关水产品的国家标准规定，高组胺鱼类及制品中组胺含量不得高于40 mg/100 g，其他海水鱼类及制品中组胺含量不得高于20 mg/100 g[10-12]。

目前，水产品中组胺检测方法主要有高效液相色谱法、比色卡法、分光光度法、胶体金免疫层析法、酶联免疫法、生物化学法、生物酶法及薄层层析法等[13-19]。比色卡法和分光光度法的应用相对广泛。分光光度法检测结果可由分光光度计直接读取，直观准确，但是需要使用分光光度计。比色卡法更适合作为快速检测水产品中组胺的方法，检测结果可由目视比色直观得到，但是比色卡法得到的结果容易受到干扰，需要不断改进[20-22]。《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》（GB 5009.208—2016）是检测水产品中组胺的标准方法。本文参照GB 5009.208—2016中第二法分光光度法，拟定偶氮试剂法-比色卡法测定组胺的实验步骤。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲈鱼、秋刀鱼、罗氏虾均购自超市，经GB 5009.208—2016第一法液相色谱法测试，本底不含组胺。

三氯乙酸（C2HCl3O2）、氢氧化钠（NaOH）、正戊醇（C5H12O）、盐酸（HCl，37%）、碳酸钠（Na2CO3）、对硝基苯胺（C6H6N2O2）、亚硝酸钠（NaNO2），均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；组胺、色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、精胺、章鱼胺、亚精胺、酪胺标准品（浓度为1 mg·mL-1），上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器设备

移液器，Eppendorf；Vortex QL-866涡旋混合器，厦门市其林贝尔仪器制造有限公司；BSA224S万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.3 实验方法

样品中的组胺经提取后，通过正戊醇萃取净化，与偶氮试剂反应生成橙色化合物，其溶液颜色的深浅在一定范围内与样品中组胺的含量呈正相关，通过组胺标准色阶卡进行目视比色，对样品中组胺进行定性判定。

1.3.1 试样制备

去头、骨、内脏、鱼皮、虾头等，取肌肉组织部分，用组织匀浆机充分粉碎混匀，装入密封袋中密封，做好标记，试样贮藏于-20 ℃冰箱中备用。

1.3.2 试样提取与测定

准确称取上述制备好的试样（2±0.02）g，置于15 mL的离心管中，加5 mL三氯乙酸溶液，摇匀后，涡旋2 min，于4 000 r·min-1下离心3 min。吸取上清液0.5 mL置于10 mL的离心管中，加入0.2 mL氢氧化钠溶液，再加入2 mL正戊醇，涡旋3 min，于4 000 r·min-1下离心1 min。取上清液0.5 mL于10 mL离心管中，加入2 mL盐酸溶液，涡旋3 min，于4 000 r·min-1下离心1 min。取下层液作为提取液。

准确吸取上述提取液0.5 mL置于5 mL离心管中，加入0.75 mL碳酸钠溶液摇匀，再加入0.75 mL偶氮试剂混匀，放置10 min。与组胺标准色阶卡目视比色，10 min内判读结果。

1.3.3 结果判定

观察待测液的颜色，与标准色阶卡比较判读样品中组胺的含量。颜色浅于检出限（200 mg·kg-1）则为阴性样品；颜色接近或者深于检出限（200 mg·kg-1）则为阳性样品。用组胺标准溶液配制成浓度系列为0 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1、400 mg·kg-1、500 mg·kg-1、600 mg·kg-1、800 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1组胺标准比色卡，见图1。

从左到右浓度梯度0～1 000 mg·kg-1逐漸增大。

1.3.4 实验方法学研究

（1）快检产品性能指标的测定。以鲈鱼、秋刀鱼和罗氏虾作为空白基质样品，添加组胺标准溶液，得到浓度分别为0 mg·kg-1（空白）、100 mg·kg-1（0.5倍LOD）、200 mg·kg-1（1倍LOD）、400 mg·kg-1（2倍LOD）的盲样各50份（0 mg·kg-1和100 mg·kg-1为阴性样品；200 mg·kg-1和400 mg·kg-1为阳性样品，以下相同），按实验步骤进行测定。

（2）交叉反应。以秋刀鱼作为空白基质样品，分别加入色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、精胺、章鱼胺、亚精胺、酪胺等标准溶液，得到浓度分别为10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400 mg·kg-1、600 mg·kg-1、800 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1、1 500 mg·kg-1、2 000 mg·kg-1、2 500 mg·kg-1的系列样品，按实验步骤进行测定，考察组胺与上述化合物的交叉反应。交叉反应率的计算公式为交叉反应率=（组胺最低检出限/其他物质最低

检出限）×100%（1）

（3）与参比方法一致性。以鲈鱼、秋刀鱼和罗氏虾作为空白基质样品，添加组胺标准溶液，制备成添加浓度为200 mg·kg-1的盲样样品各50份，按实验步骤进行测定。以现行国家标准GB 5009.208—2016第一法液相色谱法作为参比方法，对方法一致性进行研究。

（4）方法学验证。根据食药监科便函[2017]43号《食品快速检测方法评价技术规范》方法验证要求，南京工业大学（国家轻工业食品质量监督检测南京站，以下简称南京站）联络和组织了厦门市食品药品质量检验研究院（以下简称厦门院）、江苏省食品药品监督检验研究院（以下简称省食药）、江苏省产品质量监督检验研究院（以下简称省质检）、江苏省理化测试中心（以下简称省理化）、南京市产品质量监督检验院（以下简称市质检）5家方法验证单位，分别对水产品中组胺快速检测方法进行了方法学验证。选用鲈鱼、秋刀鱼和罗氏虾作为空白基质样品，添加组胺标准溶液，分别制备成浓度为0 mg·kg-1（空白）、100 mg·kg-1（0.5倍LOD）、200 mg·kg-1（1倍LOD）、400 mg·kg-1（2倍LOD）4个添加水平的盲样，每个添加水平各制备300份，总共制备3 600份，以盲样形式寄送给上述单位，按照实验步骤进行测定。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的选择与优化

参照GB 5009.208—2016第二法分光光度法，拟定偶氮试剂法-比色卡法测定组胺的步骤。

2.1.1 提取液三氯乙酸加入量的优化

准确称取制备好的试样（2±0.02）g，置于15 mL的离心管中，加入0.8 mL组胺标准溶液（1 mg·mL-1）使样品加标量为400 mg·kg-1，加入一定体积的三氯乙酸溶液，按此快速检测方法测定，观察颜色并测定吸光度，根据标准曲线计算不同加入量的回收率。样品中分别加入三氯乙酸溶液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、8 mL、10 mL，测定的稀释液吸光值分别为0.409、0.372、0.346、0.229、0.264、0.200，对应的加标回收率为68%、76%、80%、96%、80%、71%。

提取液三氯乙酸加入量和颜色变化见图2。从图2和加标回收率可以看出，当提取液三氯乙酸溶液的加入量为5 mL时，颜色反应相对适中，且回收率也比较高，因此，选取5 mL作为三氯乙酸提取溶液的加入量。

2.1.2 氢氧化钠溶液加入量对pH值的影响

由于酸碱性条件对萃取效果的影响不同，在样品经三氯乙酸提取后，用正戊醇提取前，必须使样液呈碱性，才能使组胺游离出来，便于提取。

GB 5009.268—2016分光光度法选用250 g·L-1 NaOH调节pH值在10～12。考察NaOH加入量对实验结果的影响，结果发现，只有在加入量大于0.05 mL时才能满足pH值＞10，因此研究0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL的加入量对回收率的影响，结果见表1。从表1中可以看出，当氢氧化钠溶液加入量为0.2 mL时，回收率达到98.1%，更接近100%。因此，选取0.2 mL作为氢氧化钠溶液的最佳加入量。

2.1.3 萃取过程正戊醇加入量的优化

在样品中加入0.8 mL组胺标准溶液（1 000 μg·mL-1）使样品加标量为400 mg·kg-1，按快检方法的操作步骤，观察正戊醇加入量对净化萃取样液中组胺效果的影响。正戊醇加入量对萃取效果的影响见表2，样液萃取效果见图3。从表2和图3可以看出，当加入正戊醇2 mL时，样液颜色最深，萃取效果最佳，同时回收率也是最高，达到97.3%。因此，选取2 mL作为萃取液正戊醇的加入量。

2.1.4 反萃取过程盐酸加入量的优化

反萃取过程中加入盐酸主要是使溶液呈酸性，与组胺生成组胺盐酸盐而转至盐酸提取液中，所以盐酸溶液的加入量影响组胺的反萃取效果。制备加标量为400 mg·kg-1的样品，按快检方法的操作步骤，观察盐酸溶液加入量对反萃取效果的影响并测定吸光度，计算样品加标回收率。盐酸溶液加入量为1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL时，吸光值及回收率见表3，反萃取效果见图4。从表3和图4可以看出，当加入盐酸溶液2 mL时，样液颜色最深，反萃取效果最佳，同时回收率也是最高，达到91.4%。因此，选取2 mL作为反萃取液盐酸的加入量。

2.1.5 偶氮反应pH值的影响

组胺与重氮盐偶氮反应应在弱碱环境下完成。GB 5009.268—2016分光光度法中采用2 mL提取液+3 mL 50 g·L-1碳酸钠+3 mL偶氮试剂进行反应，等比例采用0.5 mL提取液+0.75 mL 50 g·L-1碳酸钠+0.75 mL偶氮试剂时发现显色反应不明显，究其原因主要是pH值的影响，见表4。当碳酸钠浓度为50 g·L-1时，pH值约7.0，提高到100 g·L-1以上，pH值才能满足反应的要求。实验比较了100 g·L-1、150 g·L-1碳酸钠浓度对pH值的影响，发现在同样条件下，100 g·L-1浓度下的吸光值要大于150 g·L-1浓度下的吸光值，见表4，所以实验中采用0.5 mL提取液+0.75 mL 100 g·L-1碳酸钠+0.75 mL偶氮试剂。

2.1.6 反应温度、时间和稳定性

反应时间太短，溶液会呈橘黄色，而偶氮反应在室温条件下10 min以上才能充分完成，因此加完偶氮试剂后应放置10 min再进行检测。有色化合物形成后20 min内溶液红色不改变，吸收特征无变化。样品溶液稳定，适合直接测定。显色反应随时间的变化见图5，可以看出，10 min后显色反应稳定，20 min后吸光值开始下降。

2.2 产品方法性能指标的测定

產品方法性能指标的测定结果见表5。结果表明该方法的灵敏度和特异性均为100%、假阴性率和假阳性率均为0%。

2.3 交叉反应结果

色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、精胺、章鱼胺、亚精胺添加浓度为2 500 mg·kg-1时，用组胺标准比色卡进行判定，检测结果均为阴性，可以表明比色卡法中，上述试剂与组胺均无交叉反应。当酪胺添加浓度为2 000 mg·kg-1时，肉眼可观察显色开始为红色，与组胺标准比色卡的检出限200 mg·kg-1相近，为尽量避免出现假阴性结果，读数时遵循就高不就低的原则，结果判为阳性，同时可以表明酪胺与组胺存在一定的交叉反应，酪胺含量达到2 000 mg·kg-1时，交叉反应率为10%左右。

2.4 与参比方法一致性分析

以现行国家标准GB 5009.208—2016第一法液相色谱法作为参比方法，对方法一致性进行研究。与参比方法一致性分析结果见表6，结果表明在检出限浓度水平（200 mg·kg-1），本方法与参比方法相一致，符合方法一致性要求。

2.5 验证结果与汇总

6家验证单位组胺快检方法验证结果见表7，产品方法性能指标的测定结果见表8。验证结果表明该方法的灵敏度和特异性均为100%、假阴性率和假阳性率均为0%。

3 结论

组胺是所有生物胺中对人体健康危害最大的物质，并且组胺的稳定性非常好，即使经过高温蒸煮后，也不会挥发和发生变化。当人们误食含有组胺的水产品，并且摄入组胺超过1 000 mg·kg-1时，可能引发过敏性食物中毒现象。所以，国家对水产品中的组胺含量提出了严格要求，《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》（GB 2733—2015）和《食品安全国家标准动物性水产制品》（GB10136—2015）中规定，高组胺青皮红肉鱼类及制品中组胺含量应≤400 mg·kg-1，其他海水鱼类及制品中组胺含量应≤200 mg·kg-1。因此，将水产品中组胺的快速检测偶氮试剂法-比色卡法检出限设定为200 mg·kg-1。当一般鱼类和罗氏虾类的测定结果≥200 mg·kg-1时，高组胺鱼类如秋刀鱼、鲐鱼、鲹鱼、鲭鱼、沙丁鱼、鲣鱼、金枪鱼、竹荚鱼、马鲛鱼、青占鱼等青皮红肉海水鱼的测定结果≥400 mg·kg-1时，使用GB 5009.208—2016第一法液相色谱法对结果进行确证。

本方法选用偶氮试剂法-比色卡法快速检测水产品中组胺进行方法学研究。以水产品中的鲈鱼、秋刀鱼、罗氏虾作为研究基质，对本方法的显著性差异、灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、相对准确度、参比方法进行一致性分析、交叉反应率等性能指标进行了测试和计算。结果表明本方法的灵敏度和特异性均为100%、假阴性率和假阳性率均为0%、相对准确度为100%；与参比方法相一致；与其他类似生物胺交叉反应率均小于15%。本方法简单、快捷、时间短、易操作，方法假阴性率和假阳性率低，与国标法分光光度法相比提高了方法的特异性和便捷性，适合于水产品中组胺的快速检测。

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