李兰+刘俊+王丰

摘要 建立了测定胶囊壳中20种禁用工业染料的高效液相色谱-二极管阵列检测器法。样品经乙腈-甲醇溶液（1∶2， V/V）超声提取3次，以Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱为分析柱，用乙腈和含0.3%三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）进行梯度洗脱，同时在360、420、460、570和630 nm的检测波长下监测。结果表明，20种禁用工业染料在0.5～20 μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9991～1.0000，检出限为0.05～0.27 μg/mL。在1，3和10 μg/g加标水平下，20种禁用工业染料的回收率为64.1%～114.9%，日内及日间的相对标准偏差分别为0.4%～9.9%和0.9%～9.9%，定量限为0.16～2.33 μg/g。本方法操作简单，分析快速，灵敏度好，适用于胶囊壳中禁用工业染料的日常检测。

关键词 工业染料； 胶囊壳； 高效液相色谱； 二极管阵列检测

2015-12-29收稿； 2016-03-10接受

本文系国家质检总局资助项目（No.2014IK258）

E-mail： wangfeng62@126.com； xll1115@sina.com

1 引 言

工业染料是用于纺织品、皮革制品以及木制品着色的物质，以偶氮型和蒽醌型结构为主，长期使用会产生致敏或致癌作用[1，2]。我国卫生部于2008年公布的第一批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中已明确指出工业染料为非食用物质。

胶囊壳一般由明胶、食用色素及其它材料组成，它是一种特殊的药物和食品辅料，可随药物制剂或食品一起食用，为人体所吸收[3]。市售的胶囊壳颜色多彩鲜艳，常见的有红、黄、蓝、白等着色。但食品安全国家标准中并无关于特殊商品药品中着色剂的使用限量[4]，而且《中国药典》中“药用空心胶囊”质量标准中也未对着色剂进行相关的检测及限定，因此，建立胶囊壳中禁用工业染料的检测方法是很有必要的。

目前，检测食品中禁用工业染料的方法已有报道，如薄层色谱法（TLC）[5]、伏安法[6]、极谱法[7]和分光光度法[8]。这些方法简单、快速，但灵敏度低，不适合复杂基质中混合染料的测定； 液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[9～11] 灵敏度高，分辨率好，但仪器价格昂贵，操作繁琐，检测成本高； 液相色谱法（HPLC）[12，13] 使用最为普遍，简单快速，配置二极管阵列检测器减少了数据分析时间且兼顾了高的灵敏度和准确度[14，15]。刘敏等[16]在32 min内测定了15种工业染料（多为酸性染料）； 范文锐等[17]在25 min内测定了7种非食用色素； 张昊等[18]在25 min内测定了碱性橙Ⅱ等6种工业染料。基于此，本研究建立了高效液相色谱-二极管阵列检测器法，在30 min内完成了胶囊壳中20种禁用工业染料的有效分离，并获得了良好的线性范围、回收率和精密度。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1200 series高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器（美国Agilent公司）； SmarVapor RE 501 旋转蒸发仪（德国DeChem-Tech公司）； Allegra X-22R高速冷冻离心机（德国Beckman公司）； 8011ES破碎仪（美国Waring公司）； KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； Milli-Q超纯水一体机（Millipore公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯过滤膜（上海安谱科学仪器有限公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）； 三乙胺（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）； H3PO4（分析纯，西安化学试剂厂）； 20种禁用工业染料标准品（德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）：分散蓝1（CAS： 2475-45-8）、分散蓝3（CAS： 2475-46-9）、分散蓝7（CAS： 3179-90-6）、分散蓝35（CAS： 12222-75-2）、分散蓝106（CAS： 12223-01-7）、分散蓝124（CAS： 61951-51-7）、分散橙1（CAS： 2581-69-3）、分散橙3（CAS： 730-40-5）、分散橙11（CAS： 82-28-0）、分散橙37（CAS： 13301-61-6）、分散红1（CAS： 2872-52-8）、分散红11（CAS： 2872-48-2）、分散红17（CAS： 3179-89-3）、分散黄1（CAS： 119-15-3）、分散黄3（CAS： 2823-40-8）、分散黄49（CAS： 54824-37-2）、分散棕1（CAS： 23355-64-8）、碱性红9（CAS： 569-61-9）、酸性红26（CAS： 3761-53-3）、直接红28（CAS： 573-58-0）。

称取20种禁用工业染料标准品各25 mg（精确至0.0001 g），用甲醇溶解并定容至25 mL，制成混合标准储备液，于4℃保存。将混合标准储备液用甲醇逐级稀释为不同质量浓度的混合标准工作液。

将20种禁用工业染料分为A组和B组。其中A组混合标准工作液的组成为：分散蓝1、分散蓝106、分散橙1、分散橙3、分散橙37、分散红1、分散红11、分散红17、分散黄1、分散黄3、分散黄49、分散棕1、酸性红26和直接红28； B组混合标准工作液的组成为：分散蓝3、分散蓝7、分散蓝35、分散蓝124、分散橙11和碱性红9。

20种不同品牌的胶囊均购自乌鲁木齐市售药店。将胶囊中的内容物倾出，利用棉签清除胶囊壳内壁上的内容物，粉粹混匀备用。

2.2 样品制备

称取1.0 g粉碎均匀的样品于50 mL聚四氟乙烯离心管内，加入2.0 g无水Na2SO4，再加入10 mL乙腈-甲醇溶液（1∶2， V/V），涡旋混匀1 min，超声提取10 min，10000 r/min离心5 min，将上层提取液移至旋蒸瓶中，重复上述操作3次，合并提取液，40℃水浴旋蒸至尽干后，用甲醇溶解并定容至1 mL，经0.22 μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后供HPLC分析。

2.3 色谱条件

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱（250 mm × 4.6 mm，4.5 μm）； 流动相A：乙腈； 流动相B：含0.3% 三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）； 梯度洗脱程序为：0～3 min，25%～30% A； 3～4 min，30%～45% A； 4～20 min，45%～47% A； 20～22 min，47%～80% A； 22～28 min，80%～80% A； 28～30 min，80%～25% A； 30～32 min，25%～25% A。流速：1 mL/min； 柱温：50℃； 检测波长：360， 420， 460， 570和630 nm； 光谱扫描范围：200～800 nm； 进样量：10 μL。

2.4 定性与定量分析方法

以样品与标准品的色谱保留时间和DAD三维光谱图进行定性分析，以外标法进行定量分析。

3 结果与讨论

3.1 液相色谱条件的优化

3.1.1 流动相的选择 采用梯度洗脱，分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈-含0.3%三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）作为流动相时，20种禁用工业染料的分离效果。结果表明，甲醇-水和乙腈-水作为流动相时，分离效果差，部分目标物质未出峰； 乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相时，目标物质全部出峰，但分散黄3和分散橙3不能实现有效分离，且色谱峰拖尾； 乙腈-20 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相时，目标物质基本达到有效分离，但色谱峰拖尾未能得到有效改善。考虑到20种禁用工业染料大多含有NH2、NH、NN等碱性基团，在反相分离模式下，需加入适量的有机胺抑制氨基与色谱柱表面残余硅醇基之间的相互作用，从而提高分离效率，改善峰形。因此，本实验选择乙腈-含0.3%三乙胺，0.2% H3PO4溶液（pH 2.7）作为流动相。

3.1.2 柱温的选择 将柱温分别设定为30， 35， 40， 45， 50和55℃，比较20种目标物的分离效果，随着温度升高，流动相的密度、粘度减小，柱压减小，改善了传质，提高了分析速度[19]。但色谱柱的使用寿命也会减少，因此本实验确定柱温为50℃。

3.1.3 检测波长的选择 为了考察检测波长对目标物质检测灵敏度的影响，实线为A组（The solid lines indicate chromatograms of group A）； 虚线为B组（The dotted lines indicate chromatograms of group B）； 色谱峰编号同表1（The peak numbers are the same as in Table 1）。二极管阵列检测器于200～800 nm波长范围内对20种禁用工业染料进行光谱扫描。结果表明，20种禁用工业染料分别在360 nm（分散黄1、分散黄3）、420 nm（分散橙3、分散橙37）、460 nm（分散橙1、分散橙11、分散红1、分散红17、分散黄49、分散棕1、酸性红26、直接红28）、570 nm（分散红11、分散蓝124、碱性红9）、630 nm（分散蓝1、分散蓝3、分散蓝7、分散蓝35、分散蓝106）处有较大吸收。因此，本实验采用多波长检测，检测波长为360， 420， 460， 570和630 nm。

3.1.4 标准曲线、线性范围和检出限

20种禁用工业染料混合标准溶液中部分色谱峰重叠未完全分离，因此为了避免色谱峰重叠对加标回收率的影响，将20种禁用工业染料分为两组。20种禁用工业染料的液相色谱图见图1。其中，分散蓝7在色谱图中主要有两个色谱峰，因此需将峰面积加和后进行定量分析。

配制7个不同浓度（0.1，0.5，1.0，5.0，10，15，20 μg/mL）的混合标准工作液，以各浓度峰面积y对相应浓度x进行标准曲线的绘制，结果见表1。20种禁用工业染料在0.5～20 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系，线性相关系数均大于0.999。以信噪比为3时确定20种禁用工业染料的检出限，其范围为0.05～0.27 μg/mL。

3.2 样品预处理方法考察

基于20种禁用工业染料大多含有羟基、胺基、氰基等水溶性较差的官能团，实验选择甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷-乙醚溶液（1∶2， V/V）作为提取剂[17～19]，比较各提取溶剂的提取效率。丙酮、二氯甲烷-乙醚溶液作为提取剂时，酸性红26和直接红28未被提取出来，其余染料的回收率均在60%以上。可能是胶囊壳样品中蛋白质的含量较高，在深加工的过程中酸性红26或直接红28与蛋白质深度结合，导致回收率较低。乙腈作为提取溶剂时，除酸性红26和直接红28的回收率小于32%，其它目标物的回收率均达到60%以上。而甲醇对20种禁用工业染料的提取率均达到70%以上（除分散黄49的18%及分散蓝106的47%外）。综合考虑，为了弥补乙腈和甲醇单独提取时的不足，实验进一步考察了不同体积比时乙腈-甲醇溶液的提取效率。如图2所示，当乙腈-甲醇溶液体积比为1∶2时，20种禁用工业染料的回收率均大于60%。故本实验选择乙腈-甲醇溶液（1∶2， V/V）对样品进行提取。

3.3 加标回收率、精密度和定量限

以除去内容物的胶囊壳和商品胶囊壳的响应值的百分比为药品残留效应，评价胶囊壳中是否存在药品残留的干扰。当药品残留效应>1时，表现为存在干扰； 当药品残留效应<1时，表现为不存在干扰。结果表明，药品残留效应均<1，因此胶囊壳中的药品残留效应可忽略。

准确称取1.0 g的胶囊壳样品，按2.2节和2.3节进行前处理和仪器测定，当信噪比<3时，确定样品为阴性样品。选取胶囊壳阴性样品，添加3个不同加标水平（1， 3和10 μg/g）进行回收率实验，每个添加水平重复6次，结果见表2。20种禁用工业染料日内平均回收率为65.2%～114.9%，相对标准偏差为0.4%～9.9%； 日间平均回收率为64.1%～114.6%，相对标准偏差为0.9%～9.9%。20种禁用工业染料的定量限范围为0.16（分散红11）～2.33 μg/g（分散蓝35）。

3.4 方法的应用

应用本方法对市售的20种不同品牌的胶囊（已除去内容物）进行测定，结果表明，20种禁用工业染料均未检出。

4 结 论

本研究采用配置二极管阵列检测器的高效液相色谱仪建立了同时测定胶囊壳中20种禁用工业染料的分析方法。通过优化和选择最佳色谱条件，采用保留时间及DAD三维光谱图双重定性，最终在30 min内完成了20种禁用工业染料的定量分析。本方法快速、简便、准确、灵敏，适用于胶囊壳中禁用工业染料的日常分析检测。

References

1 Golka K， Kopps S， Myslak Z W. Toxicol. Lett.， 2004， 151（1）： 203-210

2 Fang G， Wu Y， Dong X， Liu C， He S， Wang S. J. Agric. Food Chem.， 2013， 61（16）： 3834-3841

3 ZENG Jin-Hong， JIANG Tao， JIAO Xin-Ping， ZHENG Yun-Feng， LIN Hai-Wa， SONG Hai-Yan， HUANG Xiao-Li. Food Research and Development， 2012， 33（5）： 133-137

曾金红， 江 涛， 焦新萍， 郑云峰， 林海娃， 宋海燕， 黄晓丽. 食品研究与开发， 2012， 33（5）： 133-137

4 GB 2760-2014， National Food Safety Standards. Using Standard of Food Additives， 2014

食品添加剂使用标准， 食品安全国家标准. 2014 GB 2760-2014

5 Soponar F， Mot A C， Srbu C. J. Chromatogr. A， 2008， 1188（2）： 295-300

6 Ni Y， Bai J， Jin L. Anal. Chim. Acta， 1996， 329（1）： 65-72

7 Combeau S， Chatelut M， Vittori O. Talanta， 2002， 56（1）： 115-122

8 Pourreza N， Ghomi M. Talanta， 2011， 84（1）： 240-243

9 CAO Peng， QIAO Xu-Guang， LOU Xi-Shan， GENG Jin-Pei， FU Jian， ZHANG Xi-Qing. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（11）： 1670-1675

曹 鹏， 乔旭光， 娄喜山， 耿金培， 付 建， 张禧庆. 分析化学， 2011， 39（11）： 1670-1675

10 HUANG Li-Ying， ZHANG Xiao-Bo， CHEN Xiao-Zhen， WANG Jin， CAO Hui， LIU Min-Fang. Journal of Instrumental Analysis， 2013， 32（6）： 687-692

黄丽英， 张晓波， 陈小珍， 王 瑾， 曹 慧， 刘敏芳. 分析测试学报， 2013， 32（6）： 687-692

11 L Feng-Lan， LIU Ji-Ning， SHI Li-Li， CHEN Guo-Song. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（1）： 39-44

吕凤兰， 刘济宁， 石利利， 陈国松. 分析化学， 2011， 39（1）： 39-44

12 Yang Y， Zhang J， Shao B. Anal. Methods， 2014， 6（15）： 5872-5878

13 Pag-ikov D， Lehotay J. J. Liq. Chromatogr. Related Technol.， 2015， 38（5）： 579-583

14 ZHENG Ming-Yue， GUO Wei， NIE Xue-Mei， YANG Ling， PAN Jia-Rong， CHU Xiao-Gang. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2012， 28（9）： 222-228

郑明月， 国伟， 聂雪梅， 杨 玲， 潘家荣， 褚小刚. 中国农学通报， 2012， 28（9）： 222-228

15 Kucharska M， Grabka J. Talanta， 2010， 80（3）： 1045-1051

16 LIU Min， LI Xiao-Lin， BIE Wei， WANG Ming-Lin， FENG Qian. Chinese Journal of Chromatography， 2011， 29（2）： 162-167

刘 敏， 李小林， 别 伟， 王明林， 冯 骞. 色谱， 2011， 29（2）： 162-167

17 FAN Wen-Rui， WU Qing， LAO Yang， LU Yu-Shan. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（2）： 292-297

范文锐， 吴 青， 劳 扬， 卢玉珊. 分析化学， 2012， 40（2）： 292-297

18 ZHANG Hao， CHEN Dong-Yang， FENG Jia-Li， ZENG Dong， WANG Yi-Hong， LI Bang-Rui. Chinese Journal of Health Laboratory Technology， 2014， 24（15）： 2167-2173

张 昊， 陈东洋， 冯家力， 曾 栋， 王一红， 李帮锐. 中国卫生检验杂志， 2014， 24（15）： 2167-2173

19 ZHAO Yi-Nan. Chinese Journal of Analysis Laboratory， 2007， 26（12）： 340-341

赵轶男. 分析试验室， 2007， 26（12）： 340-341

Abstract A high performance liquid chromatography with diode array detection method （HPLC-DAD） was established for determination of 20 forbidden industrial dyes in capsule shells. The capsule shell samples were repeatedly extracted three times under ultrasonication with acetonitrile-methanol solution （1∶2， V/V）. The extract was separated on Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column with gradient elution by using acetonitrile and 0.3% triethylamine， 0.2% phosphoric acid aqueous solution （pH 2.7） as eluant， and then monitored under the detection wavelength of 360， 420， 460， 570 and 630 nm. The results showed that the linearity of 20 forbidden industrial dyes ranged from 0.5 to 20 μg/ml with correlation coefficients of 0.9991-1.0000. The limit of detection of the instrument was 0.05 to 0.27 μg/mL. The recoveries of these dyes （spiked at levels of 1， 3， and 10 μg/g） ranged from 64.12% to 114.89%， while intra-day and inter-day relative standard deviations ranged from 0.4% to 9.9% and 0.9% to 9.9%， respectively. The Limit of quantification of the method was 0.16–2.33 μg/g. This method is sample， rapid and sensitive， and suitable for routine determination of the forbidden industrial dyes in capsule shells.

Keywords Industrial dyes； Capsule shell； High performance liquid chromatography； Diode array detection