雷 振, 杨小兵, 唐柳生

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一种慢性疾病,是全球死亡人数最多的单一病原体所致的传染病,也是全球十大死因之一[1]。随着结核病研究的不断深入,由非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria,NTM)引起的疾病也不断被发现,NTM感染与结核病临床表现相似,如果不能及时准确鉴定极易造成误诊[2],并且大多数NTM对常见的抗结核药物耐药,常规的抗结核药物治疗达不到理想的疗效。因此,寻找一种简便、快速及可靠的检测方法来进行分枝杆菌感染的诊断是目前研究的热点[3]。本研究应用PCR-荧光探针法、BD960液体培养法和直接涂片荧光染色法检测分枝杆菌,分析三种方法检测分枝杆菌感染的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2021年1月至2021年4月在广西壮族自治区胸科医院就诊的104例疑似分枝杆菌感染患者的标本,其中痰42份,支气管灌洗液42份,穿刺液8份,脑脊液8份,骨髓3份,脓液1份。104例患者中,男69例,女35例,年龄15～82岁。纳入标准:临床诊断有结核症状,影像学诊断有结核病灶。排除标准:患者标本检测失败或者标本污染。本研究经广西壮族自治区胸科医院医学伦理委员会批准(NO.2021-014)。

1.2仪器及试剂 全自动分枝杆菌培养监测仪(BACTECTMMGITTM960)、分枝杆菌培养管(1313823)和分枝杆菌培养添加试剂盒(2034928)均购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。PCR-荧光探针法所使用的FQD-96C实时荧光定量PCR分析仪购自杭州博日科技股份有限公司,试剂盒购自成都博奥晶芯生物科技有限公司。抗酸染色试剂(C210803)、硝基苯甲酸(PNB)培养基(20201218)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培养基(20201218)及中性罗氏培养基(20201222)购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.3结核病诊断标准 依据《肺结核诊断:WS288-2017》[4]进行诊断。

1.4诊断方法

1.4.1 直接涂片荧光染色法 按照《结核病诊断细菌学检验规程》[5]及试剂说明书进行操作。小心打开标本容器,用折断的竹签茬端挑取标本的可疑部分0.05～0.1 ml,在玻片正面的右侧2/3中央处均匀涂抹成1.0 cm×2.0 cm大小的卵圆形痰膜,待自然干燥后用荧光染液进行染色,自然干燥后镜检。

1.4.2 PCR-荧光探针法 严格按照试剂说明书进行操作,首先在无菌杯内加入等量的4% NaOH溶液对标本进行消化处理30 min,然后取1 ml液体加入1.5 ml EP管中,12 000 r/min离心5 min,去上清液后加入50 μl核酸提取液,充分涡旋后95 ℃水浴锅中放置5 min,5 000 r/min离心1 min。取2 μl核酸样本加入含有引物、探针、酶的18 μl扩增反应液中后放入实时荧光定量PCR仪。设置PCR扩增程序:37 ℃ 5 min、94 ℃ 3 min后,94 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s,40个循环,50 ℃10 s。检测通道同时选择羧基荧光素(carboxyfluorescein,FAM)和六氯荧光素(hexachlorofluorescein,HEX)通道,荧光采集点选择60 ℃ 30 s。样本扩增曲线呈S型,且循环阈值(Ct值)<40判定为阳性,扩增曲线不呈S型或Ct值≥40(或无任何数值)判定为阴性。FAM通道阳性,HEX通道阳性或阴性,判定为MTB。FAM通道阴性,HEX通道阳性,判定为NTM。FAM通道阴性,HEX通道阴性判定为分枝杆菌核酸检测阴性。

1.4.3 BD960液体培养法 按照《结核病诊断细菌学检验规程》[5]进行操作,首先配制4% N-乙酰半胱氨酸-氢氧化钠(N-acetyl-L-cysteine-NaOH,NALC-NaOH)标本前处理液,往50 ml离心管中加入1～2 ml标本及等量现配标本前处理液消化处理15～20 min,加无菌pH 6.8的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)至约50 ml,盖紧盖子,混合后以3 000 g离心15 min,去上清液,加1～3 ml PBS悬浮沉淀,加0.5 ml悬浮液至提前加入0.8 ml分枝杆菌培养添加剂的分枝杆菌培养管中,使用BACTECTMMGITTM960全自动分枝杆菌培养监测仪进行检测。仪器报阳后用萋尼氏染液染色镜检,确定为抗酸杆菌后用PNB/TCH培养基进行初步菌种鉴定。PNB和TCH培养基均有分枝杆菌生长判断为NTM;PNB培养基无菌生长,而TCH培养基有分枝杆菌生长或无菌生长判断为MTB。每批试验以MTB标准株H37Rv为敏感参考菌株进行质控。

1.5统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析。计数资料以例数(百分率)[n(%)]表示,采用配对χ2检验分析不同检测结果的差异情况。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1三种检测方法分枝杆菌检出情况 104份标本,PCR-荧光探针法检测阳性率为22.12%(23/104),其中MTB占56.52%(13/23),NTM占43.48%(10/23),见表1。直接涂片荧光染色法检测阳性率为18.27%(19/104);BD960液体培养法检测阳性率为32.69%(34/104),其中MTB占47.06%(16/34),NTM占52.94%(18/34)。见表2。

表1 104例PCR-荧光探针法检测情况

表2 各类样本检测情况

2.2三种检测方法检测结果比较 根据三种检测方法的检测结果,以BD960液体培养法为参照标准,BD960液体培养法与PCR-荧光探针法阳性检出率比较差异有统计学意义(P=0.013),BD960液体培养法与直接涂片荧光染色法阳性检出率比较差异有统计学意义(P<0.001)。见表3,4。

表3 PCR-荧光探针法与BD960液体培养法检测结果比较

表4 直接涂片荧光染色法与BD960液体培养法检测结果比较

3 讨论

3.1本研究分析比较了三种不同原理检测分枝杆菌感染的检测效能。BD960液体培养技术是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)认可的结核病诊断“金标准”,可反映分枝杆菌的存活能力,并能做菌种鉴定和药敏试验[6],但培养周期长,BD960液体培养阴性需要6周才能报告,且对实验室的生物安全级别要求较高。PCR-荧光探针法是采用双重PCR技术和Tagman探针(一种检测寡核苷酸的荧光探针)技术相结合,分别针对MTB复合群和分枝杆菌的特异性序列设计引物和探针,两个探针分别标记不同的荧光发光基团。检测时,当反应体系中有目的基因存在时,随着PCR反应的进行就会释放出荧光,通过监测不同通道的荧光信号变化,进而实现对MTB复合群和NTM的检测[7-8]。直接涂片荧光染色法只需要涂片干燥进行荧光染色,操作简单、快速,但检出率和灵敏度太低。

3.2三种方法检测结果显示,BD960液体培养法、PCR-荧光探针法和直接涂片荧光染色法的阳性率分别为32.69%、22.12%、18.27%。以BD960液体培养法为参照标准,BD960液体培养法与PCR-荧光探针法及直接涂片荧光染色法的检测结果比较差异有统计学意义(P<0.05)。直接涂片荧光染色法检出率与国内文献报道相似。PCR-荧光探针法近年来已广泛应用于检测分枝杆菌,其优点已在很多研究中得以证明。郭莉娜等[9]报道在不同临床标本中用PCR-荧光探针法检测分枝杆菌,检出率为10.66%,低于本研究结果(22.12%)。阳红梅等[7]和陈静等[10]的报道结果中MTB检出率分别为48.8%和39.2%,高于本研究结果[MTB检出率12.50%(13/104)]。另外,郭莉娜等[9]报道PCR-荧光探针法阳性检出率略高于传统培养及镜检方法,差异的原因可能与随机抽样有关,需要进一步研究。

3.3本研究中有7例PCR-荧光探针法检测阴性而BD960液体培养法和涂片均为阳性(NTM 6例,MTB 1例),原因可能是引物和探针设计区出现新的突变而造成的假阴性,另外样本的含血量过大(超过5%)也容易出现假阴性。本研究中还有3例PCR-荧光探针法检测阳性而BD960液体培养法和直接涂片荧光染色法均为阴性(NTM 2例,MTB 1例),可能是由于PCR-荧光探针法检测是分枝杆菌的DNA,不论死菌或活菌均能检测,而BD960液体培养法仅能检测活菌,造成死菌的原因可能是培养操作时处理不当或患者经药物治疗时排出的是死菌(或低活力),有待进一步研究。通过PCR-荧光探针法和BD960液体培养法检测结果比较发现,有1例为BD960液体培养法检测出NTM而PCR-荧光探针法检测出MTB,PCR-荧光探针法检测的阳性结果依据为FAM和HEX通道均阳性,可能是因为MTB和NTM混合生长所致。当MTB和NTM混合生长时,只能表达MTB,这也是PCR-荧光探针法检测的局限性。PCR-荧光探针法需要实验室及操作人员具有专业的核酸检测能力,且前期设备仪器投入较大,造成检测成本相对较高,在基层实验室推广使用尚需时日[11]。而直接涂片荧光染色法只有在标本菌数量>5 000～10 000条/ml才有可能检测为阳性[12],所以对取材和涂片的质量要求比较高,检验人员人工镜检的经验对结果也有很大影响,容易造成误诊和漏诊。

3.4不同样本的检测结果显示,PCR-荧光探针法检测出的23例分枝杆菌中有22例为痰和支气管灌洗液标本检测出的阳性结果,说明分枝杆菌引起人体各部位的感染以肺部感染最为常见[13-14]。3份骨髓标本检测,PCR-荧光探针法和直接涂片荧光染色法均未检测出分枝杆菌,而BD960液体培养法检测出1例MTB和1例NTM。由此可见,PCR-荧光探针法和直接涂片荧光染色法检测非痰标本分枝杆菌的效果不及BD960液体培养法。

总之,三种方法均可用于分枝杆菌的检测,各具优势。PCR-荧光探针法可快速区分MTB和NTM,适合具有核酸检测能力的实验室使用。BD960液体培养法可检测活菌,能作为临床治疗效果的观察。直接涂片荧光染色法操作简单,但无法区分MTB和NTM。应用PCR-荧光探针法、BD960液体培养法和直接涂片荧光染色法联合检测分枝杆菌,可优势互补,提高检出率,为分枝杆菌感染的早期发现和有效控制提供理想的检测方法。