马 颖, 李琴福, 祁丽霞

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一种常见的神经系统退行性疾病,患病率逐年升高,已成为神经残疾的主要原因之一[1]。高龄是患PD最重要的危险因素,且男性患病率高于女性[2-3]。尽管部分PD患者的临床特征已完全显现,但其临床诊断的准确性不高,需进一步探索新的生物标志物。既往研究显示,DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学分子机制均不同程度地参与调控PD的发病和发展过程[4]。DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在维持DNA甲基化中具有重要作用,其表达异常可能影响基因组的稳定性[5]。龟板提取物可通过DNMT1核易位和α-突触核蛋白(synuclein-alpha,SNCA)甲基化对PD模型多巴胺能神经元发挥保护作用[6]。长链非编码RNA人类母系表达基因3[long non-coding ribonucleic acid(RNA) human maternally expressed gene 3,lncRNA MEG3]在PD患者血浆中表达降低[7]。但目前关于DNMT1、lncRNA MEG3在PD发病中的诊断价值尚不清楚。鉴此,本研究旨在探讨PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3表达水平及其临床意义,现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2020年3月至2023年1月青海红十字医院神经内科收治的PD患者106例作为PD组,其中男75例,女31例,年龄40.00～82.00(65.71±11.39)岁。另选择同期本院健康体检者103名作为对照组,其中男68名,女35名,年龄40～85(65.42±10.16)岁。本研究获青海红十字医院伦理委员会批准(批号:H20191015),研究对象签署知情同意书。纳入标准:(1)患者符合原发性PD诊断标准[8];(2)病历资料完整;(3)健康体检者性别、年龄与PD患者相匹配,体格检查正常,无器质性疾病及认知障碍,无精神疾病或精神疾病史,脑CT检查无异常。排除标准:(1)合并继发性PD、其他神经系统退行性疾病、脑血管病、痴呆或脑外伤者;(2)合并免疫系统疾病、感染性疾病、严重脏器功能不全或恶性肿瘤者;(3)有药物滥用史、急慢性毒物接触史或精神疾病史者;(4)无法配合研究者。

1.2血清DNMT1表达水平测定 采用真空采血管收集研究对象治疗前晨起空腹静脉血3 ml,室温静置30 min后以3 000 r/min离心15 min,取上层血清,-80 ℃保存备检。采用酶联免疫吸附测定试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清DNMT1水平,试剂盒购自上海化邦生物科技有限公司。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3血清lncRNA MEG3表达水平测定 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清lncRNA MEG3水平。采用Trizol法提取总RNA,应用反转录试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)将其反转录为cDNA,并以cDNA为模板进行qRT-PCR。反应体系:cDNA(50 ng/μl)4 μl,qPCR SYBR Green Master Mix(上海康朗生物科技有限公司)20 μl,上、下游引物(10 μmol/L)各1.6 μl,ddH2O 12.8 μl。lncRNA MEG3上游引物5′-CGGAGAGGCCTATGTTGGT-3′,下游引物5′-GAGACGGTGAGGCTCCTG-3′;GAPDH上游引物5′-CTACGAGCTCAGCTGCAGTAT-3′,下游引物5′-GTAGCGAGTGGCATCTCGG-3′。以GAPDH为内参,通过2-△△CT法计算血清lncRNA MEG3的相对表达量。

1.4临床资料收集 通过医院电子病历系统收集研究对象的临床资料,包括性别、年龄、受教育年限、体质量指数(body mass index,BMI)、吸烟、饮酒、家族史、高血压、糖尿病等一般人口学资料。采用美国Beckman公司AU680全自动生化分析仪检测高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)等实验室指标。

1.5统一帕金森病评定量表(the Unified Parkinson′s Disease Rating Scale,UPDRS)评分及Hoehn-Yahr(H-Y)分期 (1)收集PD组患者治疗前UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分[9]。UPDRS Ⅰ评分为精神、行为和情绪评估,包括智力损害、思维障碍、抑郁、动力或始动力。UPDRS Ⅱ评分为日常生活活动评估,包括言语、唾液分泌、吞咽、书写、切割食物和使用餐具、着装、个人卫生、翻身和整理床单、跌跤、行走中冻结、行走、震颤、与PD有关的感觉主诉。UPDRS Ⅲ评分为运动检查评估,包括言语表达、面部表情、静止性震颤(面部、嘴唇、颌、右上肢、左上肢、右下肢、左下肢)、手部动作性或姿势性震颤、强直、手指拍打试验、手运动、轮替运动、腿部灵活性、起立、姿势、步态、姿势的稳定性、躯体少动。三种评分均为0～4级,分级越高患者越严重。(2)治疗前H-Y分期[10]。0期:无症状;1期:单侧疾病;1.5期:单侧和躯干受累;2期:双侧疾病和无平衡障碍;2.5期:轻微双侧疾病和后拉试验可恢复;3期:轻中度双侧疾病、某种姿势不稳、独立生活;4期:严重残疾和仍可独立站立和行走;5期:无帮助则只能卧床或坐轮椅。

2 结果

2.1两组临床资料及血清DNMT1、lncRNA MEG3表达水平比较 PD组病程为(6.69±1.26)年;UPDRS Ⅰ评分(3.62±1.04)分,UPDRS Ⅱ评分(19.78±6.35)分,UPDRS Ⅲ评分(36.03±9.85)分;H-Y分期为0期者16例(15.09%),1～1.5期者32例(30.19%),2～3期者39例(36.79%),4～5期者19例(17.93%)。PD组血清DNMT1水平高于对照组,TC、TG、LDL-C及lncRNA MEG3水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组性别、年龄、BMI、吸烟、饮酒、家族史、高血压、糖尿病、HDL-C水平、受教育年限比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组临床资料及血清DNMT1、lncRNA MEG3表达水平比较

2.2PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3水平与临床指标的相关性分析结果 Pearson相关性分析结果显示,PD患者血清DNMT1水平与TC、TG、LDL-C水平呈负相关(P<0.05),与UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分、H-Y分期呈正相关(P<0.05)。lncRNA MEG3水平与TC、TG、LDL-C水平呈正相关(P<0.05),与UPDRS Ⅰ评分、UPDRS Ⅱ评分、UPDRS Ⅲ评分、H-Y分期呈负相关(P<0.05)。见表2。

表2 PD患者血清DNMT1、lncRNA MEG3水平与临床指标的相关性分析结果

2.3PD发生的多因素logistic回归分析结果 以发生PD情况为因变量(发生=1;未发生=0),将表1中有统计学意义的指标作为自变量进行多因素logistic回归分析,结果显示,较高的血清DNMT1水平是促进PD发生的独立危险因素(P<0.05),较高的lncRNA MEG3水平是抑制PD发生的独立保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 PD发生的多因素logistic回归分析结果

2.4血清DNMT1、lncRNA MEG3水平对PD的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,血清DNMT1、lncRNA MEG3水平具有诊断PD的应用价值(P<0.05),且两指标联合可进一步提高诊断效能[AUC(95%CI)=0.906(0.865～0.947)],灵敏度和特异度分别为80.21%、89.34%。见图1,表4。

图1 血清DNMT1、lncRNA MEG3水平诊断PD的ROC曲线图

表4 血清DNMT1、lncRNA MEG3水平诊断PD的ROC曲线分析结果

3 讨论

3.1PD的病理特征包括路易体和路易神经炎形式的神经内含物,黑质和其他脑区细胞丢失[11]。尽管PD的发病机制和流行病学研究已取得一定进展,但对其病因仍不十分明确,且尚未发现有效的治愈或预防方法[12-13]。由于PD的临床特征与其他神经退行性疾病有重叠,因此PD诊断仍是目前临床面临的一个挑战[14]。

3.2既往研究显示,环境因素可能通过诱导表观遗传修饰(如DNA甲基化)导致神经退行性变,且此过程是由DNMT1等酶进行调控的[15]。Saxena等[16]研究结果发现,神经元中过表达DNMT1可造成精神分裂症相关基因失调。Zhang等[17]研究表明,在PD模型细胞和小鼠中DNMT1蛋白表达水平显著降低。而本研究结果中PD患者血清DNMT1表达上调,与Zhang等[17]的研究结果相反。分析认为在炎症等病理状态可能导致细胞破裂增加,DNMT1可能经细胞释放进入血液,使得血清DNMT1的检测浓度升高,值得扩大样本量对此进一步验证。lncRNA广泛参与代谢和免疫等关键生理过程,并与肿瘤、心血管疾病、肾病和神经系统疾病的发生、发展密切相关[18]。Zhao等[19]研究发现lncRNA MEG3在神经元细胞死亡,以及缺氧、缺血条件下血管生成等方面发挥关键作用。

3.3有研究显示,DNMT1可以通过招募甲基转移酶来促进lncRNA MEG3启动子甲基化以抑制lncRNA MEG3表达[20]。推测DNMT1、lncRNA MEG3可能共同参与PD患者神经细胞凋亡。Huang等[21]研究结果发现,lncRNA MEG3在PD患者中表达降低,lncRNA MEG3可通过调节人神经母细胞瘤细胞中富含亮氨酸重复激酶2的表达来调控细胞生存能力和凋亡。基于既往研究分析认为,病理因素造成患者体内血清DNMT1表达异常升高,促进DNA甲基化的作用增加,进而通过招募甲基转移酶促进lncRNA MEG3启动子甲基化,抑制血清lncRNA MEG3表达。另外,DNMT1、lncRNA MEG3可能共同影响PD患者神经炎症。Meng等[22]研究表明,lncRNA MEG3可通过靶向相关信号通路调节小胶质细胞炎症。推测DNMT1可能通过调控lncRNA MEG3表达,调节小胶质细胞炎症,通过影响神经炎症参与PD患者脑损伤。本研究多因素logistic回归分析及ROC曲线分析结果提示,DNMT1、lncRNA MEG3可能参与PD发病,且两指标联合检测有助于临床早期确诊PD。

3.4本研究结果显示PD患者TC、TG、LDL-C水平较健康人群低,这与张展舆等[23]研究结果相似,且各指标水平与血清DNMT1水平呈负相关,与lncRNA MEG3水平呈正相关。分析PD患者血脂水平降低的可能原因为:(1)PD患者往往伴随着交感神经活动降低,皮质醇和儿茶酚胺产生量减少,最终造成血脂水平降低。(2)在PD发展初期可能已伴随血脂水平降低,脂质水平降低可进一步降低辅酶Q的水平,而辅酶Q主要功能为神经保护和降低氧化应激,进而延迟或减少多巴胺的进一步消耗[24]。既往研究表明,DNA甲基化是环境因素(如饮食)和复杂疾病(如酒精性脂肪肝)之间的表观遗传学联系,其在肝脏脂质代谢调控中发挥重要作用,进而导致脂肪肝变性的发展[25]。Zou等[26]研究结果表明,lncRNA MEG3相关信号通路可通过控制参与脂质代谢和炎症的基因的表达,参与体内脂质积聚和炎症发应。因此推测DNMT1、lncRNA MEG3也可能通过调控体内血脂代谢的方式参与PD的疾病进展,其具体作用机制仍有待进一步研究。

综上所述,PD患者血清DNMT1呈高表达,lncRNA MEG3呈低表达,二者联合检测有助于临床诊断PD。但本文未进一步探讨PD不同亚型中血清DNMT1、lncRNA MEG3的表达水平差异,有待后续进一步扩大样本量加以研究,为PD患者的个体化治疗方法研发提供参考。