吴海涛, 李红净, 苗艳丽, 周海静, 张 曼

慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是由心室供血不足或充盈力低下引起组织器官血流灌注不足的心血管疾病终末期表现,其发病率、致残率以及致死率较高[1]。心房颤动(atrial fibrillation,AF)为严重的心房电活动紊乱,其发病率随年龄增长而上升[2]。CHF与AF可同时存在,两者既互为因果又相互促进[3]。目前,CHF患者合并AF的发病机制尚不明确,因此寻找可预测CHF患者发生AF风险的生物标志物具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200 nt的功能性RNA分子,无蛋白质编码功能,可参与早期胚胎发育、细胞增殖与凋亡、基因调节等一系列生命活动,以及冠脉粥样硬化、CHF等心血管疾病发病过程[4]。lncRNA ROR位于人类染色体18q21.31,对细胞重编程过程具有重要调控作用,能诱导多能干细胞形成[5]。研究指出,心肌细胞中的lncRNA ROR水平上调,以MR-145/Hax-1轴为靶点诱导心肌细胞缺氧损伤,引起心肌肥大[6]。微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)为内源性非编码RNA,具有调控基因、蛋白质表达等功能,部分miRNA能调控心肌细胞、成纤维细胞的增殖、分化、凋亡过程,在心血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用[7]。研究显示,miR-145可促进心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,修复梗死后的心肌细胞,其表达缺失可诱导血管平滑肌细胞发生恶性生物学行为,与心血管疾病发生有关[8]。目前lncRNA ROR和miR-145表达水平与CHF患者发生AF的关联性研究鲜有报道。鉴此,本研究通过检测CHF患者血清lncRNA ROR与miR-145的表达水平,探讨两者与AF发生的关系,为预测CHF患者发生AF风险提供新的生物标志物。

1 对象与方法

1.1研究对象 招募2019年3月至2022年12月邯郸市第一医院收治的108例CHF患者,其中男61例,女47例;年龄51～75(64.52±4.18)岁;CHF病程3～15(7.15±2.06)年;纽约心脏病协会(New York Heart Association,NYHA)心功能分级:Ⅱ级37例,Ⅲ级46例,Ⅳ级25例;合并基础疾病:高血压42例,糖尿病34例,高脂血症24例。纳入标准:(1)符合《慢性心力衰竭中西医结合诊疗专家共识》[9]中关于CHF的诊断标准,且经心电图、超声等影像学检查确诊;(2)符合《慢性心力衰竭合并心房颤动诊断与治疗中国专家共识》[10]中关于AF的诊断标准;(3)NYHA心功能分级为Ⅱ～Ⅳ级;(4)临床资料完整。排除标准:(1)合并自身免疫性疾病者;(2)合并严重感染者;(3)合并恶性肿瘤者;(4)有心脏外科手术史、AF发病史者;(5)妊娠与哺乳期妇女;(6)合并严重肝肾功能障碍者;(7)合并血栓栓塞疾病者。根据入院时AF发生情况将CHF患者分为合并AF组(n=46)和未合并AF组(n=62)。于同期纳入本院健康体检者50名作为对照组,其中男28名,女22名;年龄52～78(65.03±4.62)岁。健康体检者与CHF患者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究获邯郸市第一医院医学伦理委员会批准(批号:2019-0226),研究对象签署知情同意书。

1.2一般资料收集 通过医院电子病历系统收集CHF患者性别、年龄、CHF病程、NYHA心功能分级、合并基础疾病(高血压、糖尿病、高脂血症)、吸烟史、饮酒史等资料。

1.3实验室检查 以抗凝试管采集CHF患者入院次日清晨空腹肘静脉血10 ml,健康体检者于体检当日采集,其中5 ml血液标本以3 000 r/min离心15 min,收集血清,-80 ℃保存备检。另外5 ml血液标本用于检测总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)等生化指标水平,所用仪器为日立公司7060全自动生化分析仪。

1.4心功能检查 入院当日使用美国GE Vivid7超声诊断仪检测CHF患者的左房内径(left atrial diameter,LAD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)等心功能指标。

1.5血清lncRNA ROR、miR-145表达水平检测 应用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清lncRNA ROR、miR-145表达水平。采用Trizol法提取血清总RNA,应用反转录试剂盒(日本Takara公司)将其反转录为cDNA,并以cDNA为模板进行qRT-PCR。反应条件:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,变性退火延伸共40个循环。反应体系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl,cDNA 2.0 μl,上、下游引物各0.8 μl,ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μl,ddH2O 6.0 μl。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计与合成,引物序列见表1。以GAPDH为内参,通过2-△△Ct法计算血清中lncRNA ROR、miR-145的相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1两组临床资料比较 两组患者的性别、年龄、CHF病程、基础疾病、吸烟史、饮酒史、TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG比较差异无统计学意义(P>0.05)。合并AF组LAD、LVEDD以及LVESD高于未合并AF组,LVEF低于未合并AF组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者NYHA心功能分级比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两组临床资料比较

2.2三组血清lncRNA ROR、miR-145表达水平比较 未合并AF组、合并AF组lncRNA ROR表达水平高于对照组,且合并AF组高于未合并AF组,差异有统计学意义(P<0.05)。未合并AF组、合并AF组miR-145水平低于对照组,且合并AF组低于未合并AF组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 三组血清lncRNA ROR、miR-145表达水平比较

2.3血清lncRNA ROR、miR-145表达水平与心功能指标的相关性分析结果 Pearson相关性分析结果显示,血清lncRNA ROR表达水平与LAD、LVEDD、LVESD呈正相关(P<0.05),与LVEF呈负相关(P<0.05);miR-145表达水平与LAD、LVEDD、LVESD呈负相关,与LVEF呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 血清lncRNA ROR、miR-145表达水平与心功能指标的相关性分析结果

2.4影响CHF患者发生AF的多因素logistic回归分析结果 以CHF患者合并AF情况(未合并AF=0,合并AF=1)为因变量,以NYHA心功能分级、LAD、LVEF、LVEDD、LVESD及血清lncRNA ROR、miR-145表达水平为自变量进行多因素logistic回归分析,结果显示,NYHA心功能分级Ⅳ级、LVEF下降、lncRNA ROR水平上调是促进CHF患者AF发生的独立危险因素(P<0.05),而miR-145水平上调是抑制CHF患者AF发生的独立保护因素(P<0.05)。见表5。

表5 影响CHF患者发生AF的多因素logistic回归分析结果

2.5血清lncRNA ROR、miR-145表达水平对CHF患者AF发生的预测价值 ROC曲线分析结果显示,血清lncRNA ROR、miR-145表达水平能有效预测CHF患者AF发生,且两者联合的预测效能更优[AUC(95%CI)=0.814(0.730～0.897),P<0.001]。见表6,图1。

图1 血清lncRNA ROR、miR-145表达水平预测CHF患者发生AF的ROC曲线图

表6 血清lncRNA ROR、miR-145表达水平预测CHF患者AF发生的ROC曲线分析结果

3 讨论

3.1CHF主要由心肌炎、高血压等疾病引起,易合并呼吸衰竭、神经系统等疾病,严重情况下可引起死亡,其发病率呈上升趋势[1]。AF是一种常见且较为严重的心律失常,其发病率随年龄的增长而上升。研究显示,心室重构是CHF进展的病理基础,也是导致室性心律失常的结构基础[11]。CHF与AF可同时存在,AF发生时会造成心房收缩功能丧失,心率长期处于高频率状态可导致心力衰竭。心力衰竭发生时心脏的泵血功能减弱,心房中血液淤积而出现纤维化,其传导与兴奋性不一致可导致AF发生[12-13]。CHF患者合并AF的病死率高于单一疾病患者,但两者同时发病的作用机制尚不明确。因此,寻找血清生物标志物以预测CHF患者AF的发生风险已成为临床研究热点。

3.2lncRNA是位于细胞核或细胞浆中的功能性RNA分子,可在真核细胞中转录,但其无法编码蛋白质[14]。研究显示,部分lncRNA在心肌组织中表达,对心肌细胞凋亡、心室重构等具有特异性,说明lncRNA在心血管疾病进展中发挥重要作用[15]。lncRNA ROR位于染色体18q21.31,可通过与异质核核糖核蛋白I(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein I,hnRNPI)作用以调控DNA损伤后细胞p53的表达,抑制氧化应激,诱导细胞凋亡[16]。既往研究指出,在小鼠心力衰竭的肥大心肌细胞中lncRNA ROR表达水平上升,提示lncRNA ROR可能促使肥大心肌细胞缺血、缺氧并参与心力衰竭发生发展过程[17]。本研究结果显示,合并AF组、未合并AF组血清lncRNA ROR表达水平高于对照组,且合并AF组更高,导致该结果的原因可能是lncRNA ROR对心肌肥厚的发生与进展具有促进作用,进而参与CHF发生发展过程[18]。miRNA为非编码RNA,细胞与组织特异性较高,与心血管疾病进展有关。miR-145位于染色体5q32-33,多表达于心肌细胞和血管平滑肌中,能维持平滑肌的稳定性[19]。研究显示,miR-145能抑制钙离子磷酸化及钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ介导的信号,调节凋亡信号通路以及激酶1/核因子p65抗炎途径,进而减轻心肌缺血再灌注诱导的炎症与氧化反应,对心肌细胞的电生理具有稳定作用,减少心肌细胞凋亡[20]。本研究中CHF患者的血清miR-145表达水平下调,且合并AF组水平更低,提示miR-145参与CHF患者AF发生。其原因可能是miR-145能激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信号通路从而下调凋亡基因的表达,对心肌细胞凋亡具有抑制作用。当miR-145表达缺失可减弱对心肌细胞的保护作用,导致心肌损伤[21]。

3.3lncRNA ROR与miR-145相互作用,可作为协同调节因子[22]。本研究结果显示,血清lncRNA ROR表达水平与LAD、LVEDD、LVESD呈正相关,与LVEF呈负相关;miR-145表达水平与LAD、LVEDD、LVESD呈负相关,与LVEF呈正相关,提示血清lncRNA ROR、miR-145均与患者心功能有关,lncRNA ROR水平上调、miR-145水平下调可造成CHF患者心功能下降,对AF发生有促进作用。本研究发现,NYHA心功能分级Ⅳ级、LVEF下降、lncRNA ROR水平上调是促进CHF患者AF发生的独立危险因素,而miR-145水平上调是抑制CHF患者AF发生的独立保护因素。NYHA心功能分级和LVEF均是评估心功能的重要指标,NYHA心功能分级等级越高,表示患者心功能越差,LVEF下降表示患者心功能降低,增加CHF患者AF发生的风险。lncRNA ROR水平在缺氧条件下以时间依赖方式上调,过表达可挽救缺氧诱导的细胞活性抑制与细胞凋亡,低氧诱导的lncRNA ROR水平上调降低了细胞对低氧反应下的保护机制。miR-145过表达可减弱lncRNA ROR对低氧诱导的保护作用,lncRNA ROR的抗缺氧作用可能是lncRNA ROR通过抑制miR-145激活RAS蛋白/RAF蛋白/丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶/核因子-κB和PI3K/AKT信号通路,以保护心肌细胞免受缺氧引起的损害[23]。ROC曲线分析结果显示,血清lncRNA ROR、miR-145单独及联合预测AF的AUC分别为0.699、0.750、0.814,表明lncRNA ROR、miR-145对CHF患者AF发生具有较高的预测价值,且两者联合的预测价值更高,说明这两个指标可作为临床早期预测CHF患者AF发生的血清生物标志物。

综上所述,CHF患者血清lncRNA ROR、miR-145与心功能有关,两者联合对于CHF患者AF发生具有较高的预测价值。