刘 元,谢婷婷,尹朗庭,刘 斌,赵君文,孙 卓,效 梅,安立龙

(广东海洋大学 滨海农业学院 广东省特色家禽生态健康养殖科技创新中心,广东 湛江 524088)

小肠是家禽消化和吸收营养物质的重要器官之一,又是保持机体内环境稳定的先天性屏障。营养物质与小肠的接触面积决定着吸收营养物质量的多少,肠道形态结构显示着肠道吸收功能的强弱。在全球日益暖化以及高密度养殖的趋势下,加之广东湛江地区高温、高湿的气候特点,热应激已经成为影响湛江地区家禽肠道黏膜损伤的重要原因之一[1]。体温调节是动物维持自身内环境稳态的一种方式,当动物自身产热和散热不平衡时,则会产生热应激[2]。家禽因其缺乏汗腺、被覆羽毛、代谢速率快和体温偏高等生理特点,更容易受到热应激[3]。高温环境下,家禽血液供应减少和采食量减少,引起氧化应激和炎症反应,最终导致肠道形态改变和黏膜损伤[4]。

热应激还会引发家禽的散热系统失衡,机体自身温度升高,产生大量自由基并且产生氧化还原反应,造成组织器官发生凋亡。致使家禽免疫功能遭到破坏,免疫力下降,从而影响家禽的产蛋率、采食量、体质量和死亡率等[5]。谷胱甘肽过氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是最重要的抗氧化酶;鸡总抗氧化能力(total antioxidant capacity of chickens,T-AOC)则代表了机体总抗氧化水平;丙二醛(malondialdehyde,MDA)是脂质过氧化的终产物,其含量水平可反映脂质过氧化的程度。MORALES等[6]研究发现热应激可以降低猪绒毛高度、回肠中BOAT2的相对表达。欧阳经鑫等[7]研究显示热应激可以降低肉鸡回肠黏膜CAT和SOD活性以及T-AOC。也有研究发现在高温环境下鸡肠道屏障和黏膜免疫系统受到损伤[8]。另外研究发现,高温环境导致猪肠道绒毛受损、绒毛高度降低、隐窝深度增加、上皮细胞凋亡脱落、肠道黏膜形态改变、结构损伤严重[9]。

怀乡鸡具有(皮黄、脚黄、羽毛黄)特征,与惠州胡须鸡、清远麻鸡并称“广东三大名鸡”。其肌肉丰满、肉质嫩滑、色泽鲜亮、美观、脂肪含量低,因此受到高级饭店和当地人的喜爱[10]。但是广东省地处亚热带地区,高温、高湿的环境严重影响了家禽的生长性能和生产性能,导致养殖的经济效益下降。添加天然绿色的饲粮添加剂是缓解热应激对家禽造成影响的主要方法之一。

斑蝥黄是一种双酮类胡萝卜素,具有抗氧化能力。郭冠群[11]研究发现饲粮中添加斑蝥黄能提高蛋鸡抗氧化酶活性,改善空肠形态结构。李俊等[12]研究发现斑蝥黄能提高海兰褐蛋鸡抗氧化能力。也有研究显示饲粮中添加斑蝥黄可以显著提高雏鸡的抗氧化性能[13]。BONAMIGO等[14]研究发现在日粮中饲喂斑蝥黄可以使肉鸡体质量增加,胸肉产量更高,骨阻力增加。斑蝥黄作为一种新型抗氧化添加剂,能否在一定程度上改善怀乡鸡在热应激条件下小肠黏膜结构损伤,国内尚未与相关报道。

因此,本试验以怀乡鸡为实验动物,通过在饲粮中添加不同浓度的斑蝥黄后,检测小肠组织抗氧化酶含量、抗氧化相关基因的表达情况、肠道黏膜形态变化以及组织细胞凋亡情况,评估饲粮中添加斑蝥黄对抗热应激的作用效果。为斑蝥黄作为抗热应激添加剂在家禽生产上的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计216只健康状况良好的26周龄雌性怀乡鸡,购自广州喜迎珍禽养殖有限公司,随机分为3个处理组,每组设置6个重复,每个重复6只鸡。适应性饲养至28周开始进行温度控制,试验期为4周。试验分组如表1所示,常温对照组(NC)饲养于正常温度(25±1)℃,饲喂基础日粮;高温对照组(HC)饲养于高温环境(32±1)℃,采用循环高温(8 h/d),饲喂基础日粮;4个高温处理组HT1(基础饲粮+4 mg/kg斑蝥黄)、 HT2(基础饲粮+6 mg/kg斑蝥黄)、HT3(基础饲粮+8 mg/kg斑蝥黄)、HT4(基础饲粮+10 mg/kg斑蝥黄)饲养于高温环境(32±1)℃,采用循环高温(8 h/d)。本试验鸡舍相对湿度均控制在55%～70%之间,饲粮添加所用斑蝥黄有效含量为10%,购于法国帝斯曼维生素贸易(上海)有限公司。

表1 试验分组

1.2 试验试剂总RNA提取试剂盒(RC101)购于南京诺唯赞生物科技有限公司;逆转录试剂盒(11119ES60)和荧光定量试剂盒(11202ES08)购于上海翊圣生物科技有限公司;TUNEL试剂盒(P1086)购于上海碧云天生物科技有限公司;ELISA试剂盒(P1066)购于江苏酶免生物科技有限公司。

1.3 样品采集于31周龄日,提前禁食12 h,随机从每个重复中选取1只鸡进行安乐死,解剖后采集十二指肠、空肠和回肠中段约2 cm左右的肠管,用预冷1×PBS清洗内容物,将采集的组织样品分为3部分。第1部分:在4%多聚甲醛溶液中固定,用于组织切片的制作;第2部分在电镜液中固定,用于组织电镜制作;第3部分用液氮快速冷冻后移至-80℃保存,用于后续的试验分析。

参照《中华人民共和国专业标准》黄羽肉鸡种鸡的饲养标准,制定试验基础饲粮配方(表2)。

表2 试验基础饲粮配方 %

1.4 测定指标与方法

1.4.1小肠抗氧化指标的测定 将采集的样品进行低温研磨制备组织匀浆,离心后提取上清。参照江苏酶免生物科技有限公司ELISA试剂盒说明书,测定小肠组织中丙二醛(MDA)、CAT、SOD、T-AOC和GSH-Px的含量。

1.4.2实时荧光定量PCR 参考南京诺唯赞生物科技有限公司RNA提取试剂盒步骤,提取十二指肠、空肠、回肠组织的总RNA,微量紫外分光光度计(中国,MB530)检测RNA 样品的纯度和浓度后,参考上海翊圣生物科技有限公司反转录试剂盒将RNA样品反转录成 cDNA ,于-20℃保存备用。实时荧光定量PCR反应条件为:95℃预变性5 min;95℃变性10 s;60℃退火延伸30 s,循环40次。目的基因及内参基因的详细引物序列见表3,反转录反应体系(20 μL)见表4,荧光定量PCR反应体系见表5。

表3 引物序列

表4 反转录反应体系(20 μL)

表5 荧光定量PCR反应体系

1.4.3肠绒毛超微结构观察 将固定好的十二指肠、空肠、回肠组织样品送至武汉博尔夫生物技术公司进行超薄电镜切片的制作,电镜(HITACHIU8010,日立)下观察小肠绒毛超微结构。

1.4.4小肠细胞凋亡的测定 将制做好的小肠白片通过TUNEL染色法进行脱蜡染色,并使用DAPI复染细胞核,于尼康荧光倒置电子显微镜下观察并采集图像。

2 结果

2.1 斑蝥黄对高温环境中成年怀乡鸡小肠抗氧化性的影响

2.1.1斑蝥黄对高温环境中成年怀乡鸡小肠MDA含量的影响 由表6可知,高温条件下,HC组中十二指肠、空肠、回肠黏膜MDA含量均显著高于NC组(P<0.05);饲粮中添加斑蝥黄后,HT1、HT2、HT3、HT4组十二指肠、空肠、回肠黏膜中的MDA含量均显著低于HC组(P<0.05);但是与NC组相比,HT1、HT2、HT3、HT4组MDA含量均未恢复到常温水平。

表6 斑蝥黄对高温环境中怀乡鸡小肠MDA含量的影响 nmol/g

2.1.2斑蝥黄对高温环境中成年怀乡鸡小肠GSH-Px活性的影响 由表7可知,高温条件下,HC组中十二指肠、空肠、回肠中的GSH-Px活性均显著低于NC组(P<0.05);饲粮中添加斑蝥黄后,HT1、HT2、HT3、HT4组空肠、回肠中的GSH-Px活性均显著高于HC组(P<0.05);但是与NC组相比,HT1、HT2、HT3、HT4组GSH-Px活性均未恢复到常温水平。

表7 斑蝥黄对高温环境中怀乡鸡小肠GSH-Px活性的影响 U/g

2.1.3斑蝥黄对高温环境中成年怀乡鸡小肠T-AOC活性的影响 由表8可知,高温条件下,HC组十二指肠、空肠、回肠中的T-AOC活性均显著低于NC组(P<0.05);饲粮中添加斑蝥黄后,HT1组的十二指肠中的T-AOC活性显著高于HC组(P<0.05),但是空肠和回肠中T-AOC活性与HC组相比,差异不显著(P>0.05);而HT2、HT3、HT4组中十二指肠、空肠、回肠中的T-AOC活性均显著高于HC组(P<0.05);但是与NC组相比,HT1、HT2、HT3、HT4组均未恢复到常温水平。

表8 斑蝥黄对高温环境中怀乡鸡小肠T-AOC活性的影响 U/g

2.1.4斑蝥黄对高温环境中成年怀乡鸡小肠T-SOD活性的影响 由表9可知,高温条件下,HC组十二指肠、空肠、回肠中的T-SOD活性均显著低于NC组(P<0.05);饲粮中添加斑蝥黄后,HT1、HT2、HT3、HT4组十二指肠、空肠、回肠中的T-SOD活性显著高于HC组(P<0.05);但是与NC组相比,HT1、HT2、HT3、HT4组均未恢复到常温水平。

表9 斑蝥黄对高温环境中怀乡鸡小肠T-SOD活性的影响 U/g

2.2 斑蝥黄对高温环境中成年怀乡鸡小肠相关抗氧化基因表达的影响由图1可知,与NC组相比,高温环境下, HSP90AA1、CAT、GPX1和NFE2L2在十二指肠、空肠和回肠中表达也呈下调趋势(P>0.05),但只有HSP90AA1在十二指肠中呈差异显著下调(P<0.05);SOSTM1在十二指肠和空肠中差异显著上调表达(P<0.05),在回肠中的表达呈上调趋势,但差异不显著(P>0.05)。与HC组相比,饲粮中添加10 mg/kg斑蝥黄后,HSP90AA1、CAT、GPX1和NFE2L2在十二指肠、空肠和回肠中表达也呈上调趋势,但差异不显著(P>0.05);SOSTM1在十二指肠和空肠中差异显著下调表达(P<0.05),在回肠中的表达呈下调趋势,但差异不显著(P>0.05)。

A.HSP90AA1 mRNA表达量;B.CAT mRNA表达量;C.GPX1 mRNA表达量;D.NFE2L2 mRNA表达量;E.SOSTM1 mRNA表达量。*.P<0.05

2.3 小肠绒毛形态特征根据2.1的研究结果表明,饲粮中添加8～10 mg/kg斑蝥黄有效改善小肠的抗氧化能力。为了评估饲粮中添加斑蝥黄对肠道组织抗热应激的作用效果,通过扫描电镜观察小肠绒毛微结构。

2.3.1十二指肠绒毛超微结构 结果如图2所示,常温条件下,NC组十二指肠微绒毛排列相对紧密有序、微绒毛无断裂。与NC组相比,HC组十二指肠微绒毛排列松疏间隙增大,并且伴有微绒毛断裂;饲粮中添加斑蝥黄后,与HC组相比,肠绒毛断裂程度有所改善;但与NC组相比,2个HT组十二指肠仍出现部分绒毛断裂和萎缩,但由此可见,饲粮中添加8～10 mg/kg浓度斑蝥黄可以有效改善高温造成的十二指肠结构损伤,其中以8 mg/kg的浓度效果最佳。

图2 十二指肠微绒毛电镜图

2.3.2空肠绒毛超微结构 结果如图3所示,常温条件下,NC组空肠微绒毛排列相对紧密有序、无间隙、有少许脱落;与NC组相比,HC组空肠微绒毛疏松,间隙明显增大,多数微绒毛断裂且脱落。饲粮中添加斑蝥黄后,与NC组相比,2个HT组空肠仍出现部分微绒毛脱落和萎缩,但与HC组相比,微绒毛间隙减小,排列紧密,脱落面积减少。由此可见,饲粮中添加8～10 mg/kg斑蝥黄可以有效改善高温造成的空肠结构损伤,其中以10 mg/kg的浓度效果最佳,但无法恢复到正常状态。

2.3.3回肠绒毛超微结构 结果如图4所示,常温条件下,NC组回肠微绒毛之间排列紧密无断裂,间隙较小,几乎无脱落。与NC组相比,HC组回肠微绒毛排列松疏,间隙显著增大,并且伴有微绒毛断裂,较多微绒毛发生脱落;饲粮中添加斑蝥黄后,与NC组相比,2个HT组回肠仍出现部分绒毛断裂和脱落,但与HC组相比,肠绒毛断裂程度有所改善。由此可见,饲粮中添加8～10 mg/kg斑蝥黄可以有效改善高温造成的回肠结构损伤,其中以10 mg/kg的浓度效果最佳,但无法恢复到正常状态。

2.4 TUNEL检测怀乡鸡小肠组织细胞凋亡情况为了进一步验证,斑蝥黄对小肠组织的损伤修复功能,通过TUNEL法检测饲粮中添加8～10 mg/kg斑蝥黄后小肠组织的凋亡情况。

2.4.1十二指肠组织细胞凋亡情况 结果如图5所示,与NC组相比,HC组十二指肠组织绿色荧光细胞数量最多;饲粮添加斑蝥黄后,与HC组相比,HT3、HT4组凋亡细胞数量明显减少,尤其是10 mg/kg斑蝥黄添加组。

2.4.2空肠组织细胞凋亡情况 结果如图6所示,与NC组相比,HC组空肠组织绿色荧光细胞数量最多,分布面积更大,绿色荧光区域更加集中;饲粮添加斑蝥黄后,与HC组相比,HT3、HT4组凋亡细胞数量明显减少,10 mg/kg斑蝥黄添加组更为明显。

图6 空肠组织凋亡

2.4.3回肠组织细胞凋亡情况 结果如图7所示,与NC组相比,HC组回肠组织绿色荧光细胞数量更多,荧光区域比较集中;饲粮添加斑蝥黄后,与HC组相比,HT3细胞凋亡数无明显变化,分布面积较大,HT4组绿色荧光细胞数量明显减少,10 mg/kg斑蝥黄添加组效果最佳。

3 讨论

3.1 斑蝥黄对高温环境下成年怀乡鸡小肠抗氧化性能的影响氧化应激是动物体内存在的过氧化物和自由基等活性氧和超过了其抗氧化缓冲能力而造成的[15]。家禽的氧化抗氧化系统相互作用,维持机体的氧化平衡,当家禽处于高温条件下时,可以通过 SOD、GSH-Px、T-AOC 活性和 MDA 含量的变化评估机体氧化应激的程度;在细胞中,MDA通过细胞脂质过氧化破坏细胞膜的结构和功能,引起蛋酶的活性进而被破坏,促使组织细胞凋亡[16]。GSH-Px广泛存在于机体中,其作用是分解过氧化物,清除细胞产生的过氧化物和自由基,抑制组织器官的氧化应激[17]。CAT是过氧化物酶的标志酶,在过氧化物酶体酶总量中占比最大,其抗氧化机理是催化过氧化氢分解成氧和水。高温环境下,CAT的活性下降,抗氧化系统被破坏,无法及时清除大量自由基,打破了机体的氧化平衡,从而引起氧化应激[18]。T-SOD是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员,它通过催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢,在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用[19]。张茜等[20]研究发现对成年罗曼蛋鸡进行32～38℃的热应激后,高温对照组的SOD、T-AOC和GSH-Px均低于常温组,MDA高于常温组。

本次研究发现,高温造成怀乡鸡十二指肠组织发生氧化应激,MDA活性显著升高,GSH-Px、CAT、T-SOD和T-AOC活性显著降低;饲粮中添加斑蝥黄后,MDA含量显著降低,而GSH-Px、CAT、T-SOD和T-AOC活性显著升高,其中以添加10 mg/kg斑蝥黄效果最为明显。同时,在饲粮中添加10 mg/kg斑蝥黄后,抗氧化相关基因SOS-TM1在十二指肠和空肠中差异显著下调表达。由此证明高温条件下斑蝥黄可以提高小肠的抗氧化性能。可见,高温打破了家禽氧化抗氧化平衡,降低了抗氧化酶活性,提高了脂质过氧化物含量,本试验研究结果与已发表论文研究结果一致,热应激会导致怀乡鸡处于氧化应激状态降低抗氧化能力。

3.2 斑蝥黄对高温环境下成年怀乡鸡小肠结构形态的影响小肠是消化食物和吸收营养物质的主要场所[21]。在本试验中,电镜结果显示HC组十二指肠、空肠绒毛的长度不一,粗细不均匀,微绒毛断裂较多,有不同程度的脱落,上皮细胞之间疏松有大小不一的间隙,添加斑蝥黄可以缓解高温对其造成的损伤。高温会导致家禽小肠屏障完整性丧失(或肠屏障功能障碍)导致肠通透性增加,发生肠漏,引起局部甚至全身的炎症反应[22]。有研究发现肉鸡肠道受到高温破坏时,会缩短绒毛和加深隐窝[23],这与本试验研究结果一致。在高温环境下,热应激会导致肠道氧化应激和炎症进而引起肠道形态改变和损伤。有研究发现,热应激会使雌性仔鸡空肠的绒毛高度和绒毛表面积均显著降低[24]。SONG等[25]研究发现将肉鸡每天处于10 h的33℃高温环境中,连续20 d后,肉鸡的空肠绒毛高度降低;本试验前期的研究也发现,高温会破坏怀乡鸡小肠黏膜结构,使得小肠绒毛高度增加,隐窝深度加深。

3.3 斑蝥黄对高温环境下成年怀乡鸡小肠组织细胞凋亡的影响有研究发现高温环境可以增加小肠细胞凋亡从而阻碍消化器官的发育,影响肠道消化酶的活性,损害肠上皮细胞,从而破坏肠道的形态[26]。另外,高温环境会加剧线粒体ETC的反应,导致ROS过量产生,从而引发氧化应激,包括诱导的线粒体蛋白质氧化、脂质过氧化和DNA损伤,最终促使细胞凋亡[27-29]。本试验结果表明高温环境促进怀乡鸡小肠组织细胞的凋亡。也有研究表明在饲粮中添加类胡萝卜素可以减少仔鸡十二指肠和空肠凋亡相关基因的表达[30]。本研究通过添加斑蝥黄缓解高温环境下小肠组织细胞的凋亡。这些研究表明,高温是导致小肠组织绒毛脱落、断裂以及发生组织细胞凋亡的主要原因,并且组织细胞凋亡与机体产生氧化应激呈正相关[31]。