郭笑然,韩 颖,刘帅峰,刘小娜,雷白时,张武超,赵 款,2*,袁万哲,2*

(1.河北农业大学 动物医学院,河北 保定 071001;2.河北省兽医生物技术创新中心,河北 保定 071001)

塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一种单股正链RNA病毒,该病毒属于小核糖核酸病毒科、塞内卡病毒属,其病毒基因组约为7.2 kb[1]。最初SVA在PER.C6的细胞培养基中发现并分离出来,后来发现猪可以感染SVA,感染后吻端和蹄部冠状带出现水泡、并伴有跛行、厌食和嗜睡,与口蹄疫、猪水疱性口炎、猪水疱病等具有相似的临床症状[2-3]。

自2014年以来,在加拿大、美国、巴西和中国等多个国家暴发了由SVA引起的水疱性相关疾病,造成了巨大的经济损失[4-6]。虽然近年来SVA得到了广泛研究,但是目前仍然没有针对SVA的相关疫苗。美国布鲁金斯州立大学SHARMA等[7]利用反向遗传操作系统对SVA进行改造,拯救出1株重组的致弱病毒(rSVA mSacⅡ),通过体内试验证实该重组病毒感染猪后未表现出任何临床症状,减弱了病毒血症,口腔、鼻腔分泌物和粪便排毒量明显减少。虽然该重组病毒被致弱,但是该病毒保留了良好的免疫原性,能够刺激机体诱导产生针对SVA的中和抗体,对猪起到保护作用。虽然弱毒疫苗可以诱导更长时间的免疫反应,但是弱毒疫苗存在毒力返强等安全性隐患[7]。YANG等[8]对SVA灭活疫苗进行了相关研究和评价,结果表明,SVA灭活疫苗也能够对猪只起到很好的保护作用。但是传统灭活苗免疫效果持续时间短,常需多次免疫才能得到较好保护,费时费力且成本较高,有必要对其进行改造。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因全长为435 bp,编码144个氨基酸,通过增殖、活化树突状细胞(DC),刺激产生细胞因子,增强抗原递呈能力,促进T细胞的成熟和分化[9]。目前,GM-CSF已经成为公认的疫苗佐剂,在肿瘤、病毒疫苗研究中广泛应用,并具有良好的免疫应答增强作用。已报道选用GM-CSF可以增强机体对猪繁殖与呼吸综合征病毒[10]、猪圆环病毒2型[11]、口蹄疫病毒[12]的免疫应答能力。基于此,本研究利用实验室构建的SVA反向遗传操作系统,在其基因组插入GM-CSF,获得嵌合GM-CSF的重组A型塞内卡病毒,为该病的预防和控制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和载体SVA HeB-2019(GenBank:MZ375462)毒株的全长cDNA感染性克隆rSVA由本实验室构建并保存[13],重组质粒pGM-CSF-T2A、pOK-CMV-Actin载体和幼仓鼠肾细胞(BHK-21)均由实验室保存。

1.2 主要试剂PrimeSTAR©HS DNA Polymerase购自TaKaRa公司;限制性核酸内切酶和NEB-uilder HiFi DNA同源重组试剂盒购自NEB公司;X-tremeGENE HP DNA转染试剂购自Roche公司;DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;DMEM细胞培养基购自Gibico公司;抗猪GM-CSF蛋白的多克隆抗体(PAb)购自RD公司;羊抗兔IgG-FITC 和羊抗猪IgG-RBITC均购自索莱宝生物科技有限公司。

1.3 嵌合GM-CSF的重组SVA的构建与拯救

1.3.1rSVA-GM-CSF感染性克隆的构建 以实验室前期构建的SVA/HeB-2019全长感染性克隆rSVA为基础,在基因组2A和2B蛋白间插入GM-CSF-T2A基因,构建重组质粒SVA-GM-CSF。其中T2A为明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)的2A基因,其编码的2A蛋白具有高效的体内自我剪切活性[14]。根据已知SVA 2A、2B位置和序列设计相应同源臂引物,以重组的pGM-CSF-T2A为模板,分别采用GM-CSF-F/R引物,通过PCR扩增得到pGM-CSF-T2A片段;以本实验室前期构建rSVA cDNA感染性克隆质粒为模板,分别利用B1-F/R、B3-F/R引物扩增得到SVA-B1和SVA-B3片段;以B1-F/B3-R为引物,通过融合PCR方法将GM-CSF-T2A插入到SVA的2A和2B之间获得融合片段SVA-B-GM-CSF;利用A-F/R和C-F/R引物,以rSVA cDNA感染性克隆质粒为模板,PCR扩增得到SVA-A和SVA-C片段,引物序列见表1。将pOK-CMV-Actin利用EcoR Ⅰ线性化,将线性化片段与SVA基因组的A、B-GM-CSF和C片段通过NEB-uilder HiFi DNA同源重组试剂盒克隆至pOK-CMV-Actin载体,转化到DH5α感受态细胞,经菌液PCR和测序鉴定阳性即获得基于真核双启动子的重组质粒SVA-GM-CSF(图1)。

图1 重组病毒SVA-GM-CSF的构建策略

A.Mock;B.SVA;C.rSVA-GM-CSF

M.DL2000 DNA Marker;1.rSVA-GM-CSF;2.SVA;3.Mock

表1 RT-qPCR引物

1.3.2rSVA-GM-CSF的拯救 当单层BHK-21细胞生长至80%时,取3 μg rSVA-GM-CSF重组质粒在6 μL X-tremeGENE HP DNA的介导下进行转染,同时用等量的X-tremeGENE HP DNA设空白对照,置于含5%CO2的37℃培养箱中培养72 h后收获病毒。反复冻融3次后继续在BHK-21细胞上传代,直到病毒能够稳定产生致细胞病变效应。将拯救出的病毒命名为rSVA-GM-CSF。

1.3.3重组病毒的RT-PCR扩增 提取重组病毒和亲本病毒的RNA,以总RNA为模板反转录获得cDNA,以此为模板,利用特异性引物GM-CSF-F/R进行RT-PCR扩增。PCR产物为在1%琼脂糖凝胶上进行电泳并测序。

1.3.4间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA) 将F5代重组病毒和亲本病毒分别感染BHK-21细胞,24 h后弃培养液,用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%Triton X-100通透20 min,5%BSA 37℃封闭1 h。分别用抗SVA VP2 蛋白的多克隆抗体(1∶200)和抗猪GM-CSF蛋白的多克隆抗体(1∶250)作为一抗,荧光标记的羊抗兔IgG-FITC和羊抗猪IgG-RBITC为二抗进行IFA鉴定。

1.3.5重组病毒的生长曲线 为评价重组病毒的生长特性,将F5代重组病毒和亲本病毒以0.5 MOI分别感染BHK-21细胞,收取12,24,36,48,60,72 h病毒上清液。将收获的病毒进行10倍梯度稀释,每个稀释度重复8次,观察细胞病变情况并记录细胞病变,利用Reed-Muench法测定不同时间点的TCID50,绘制病毒一步生长曲线。

1.3.6遗传稳定性分析 为了评估插入外源片段重组病毒的遗传稳定性,将重组病毒在BHK-21细胞上连续传至10代,取F5、F10代细胞培养上清提取病毒RNA,以总RNA为模板反转录后得到cDNA,以此为模板,采用引物SVA-F/R对外源基因进行RT-PCR扩增及测序鉴定。

2 结果

2.1 SVA-GM-CSF全长cDNA感染性克隆的构建利用PCR方法分别扩增得到SVA-A、SVA-B-GM-CSF和SVA-C片段,再利用NEB-uilder HiFi DNA同源重组试剂盒将3个片段克隆至pOK-CMV-Actin载体,最终构成重组质粒SVA-GM-CSF(图2)。

2.2 rSVA-GM-CSF的拯救将测序鉴定正确的重组质粒SVA-GM-CSF转染BHK-21细胞72 h后收取细胞上清,反复冻融3次后接种到BHK-21细胞盲传。结果显示,随着代次的升高,出现CPE的时间逐渐变短,病变也更加明显。当传至F5代时,细胞在36 h出现明显CPE,细胞圆缩,脱落,与其亲本病毒产生的CPE一致(图3)。

2.3 rSVA-GM-CSF的鉴定

2.3.1重组病毒的RT-PCR扩增与测序鉴定 收取第5代重组病毒的细胞上清液,提取病毒RNA,用引物GM-CSF-F/R扩增重组病毒所含的GM-CSF基因片段,1%琼脂糖凝胶核酸电泳结果显示,可得到长约596 bp的目标片段(图4)。将目的片段正确的PCR产物纯化回收后送至公司测序,结果表明插入的外源片段GM-CSF的序列没有发生缺失和突变。

2.3.2rSVA-GM-CSF的间接免疫荧光鉴定 重组病毒rSVA-GM-CSF与亲本毒分别感染BHK-21细胞,在感染后24 h,采用抗SVA VP2蛋白和GM-CSF的多克隆抗体分别进行IFA检测,间接免疫荧光结果显示,重组病毒和亲本病毒感染BHK-21细胞均出现SVA特异性绿色荧光;重组病毒感染BHK-21细胞后可检测到抗GM-CSF的特异性红色荧光,而亲本毒未观察到荧光,表明重组病毒感染BHK-21细胞后插入的GM-CSF基因能够正确表达(图5)。

A,d.rSVA-GM-CSF;b,e.SVA;c,f.Mock

2.4 rSVA-GM-CSF的生长动力学分析为验证rSVA-GM-CSF重组病毒与亲本毒之间生长特性的差异,分别将SVA和rSVA-GM-CSF感染BHK-21细胞,分析病毒生长曲线。试验结果表明,重组病毒与亲本病毒在BHK-21细胞中表现相似的生长曲线。均在感染12 h后病毒滴度逐步上升,在36 h病毒滴度达到最高值,之后趋于平稳(图6)。

图6 rSVA-GM-CSF病毒及其亲本毒株的生长曲线

A.rSVA-GM-CSF的PCR鉴定(M.DL2000 DNA Marker;1.Mock;2.rSVA-GM-CSF F5;3.rSVA-GM-CSF F10;4.SVA);B.rSVA-GM-CSF测序鉴定

2.5 rSVA-GM-CSF的遗传稳定性分析为进一步分析rSVA-GM-CSF重组病毒遗传稳定性,将rSVA-GM-CSF重组病毒连续在BHK-21细胞传代10次,分析其插入的外源基因GM-CSF遗传稳定性。对重组病毒rSVA-GM-CSF F5和F10代进行RT-PCR扩增,结果表明rSVA-GM-CSF重组病毒能够扩增出1 476 bp目的条带,而不含有GM-CSF基因的亲本病毒rSVA只能扩增出990 bp的目的条带(图7A)。此外,对重组病毒rSVA-GM-CSF F5和F10代RT-PCR产物进行测序,发现GM-CSF-T2A基因序列没有出现突变的现象(图7B)。

3 讨论

SVA自2015年传入我国广东,目前己蔓延至广西、福建、湖北和黑龙江等多个省份,给我国养猪业的健康发展带来很大的潜在威胁[15]。虽然近年来SVA得到了广泛研究,但是目前国内外尚无防控该病的疫苗,部分实验室研制了SVA常规灭活疫苗可有效防控该病。但是传统灭活苗免疫时间短,细胞免疫效果比较差,因此,提高灭活疫苗的免疫效果对于该病的防控有重要意义。

随着病毒反向遗传操作技术的发展和应用,通过对病毒基因组的操控可以对毒株进行改造,以此来获得理想的疫苗株。已有研究报道,利用反向遗传操作技术,建立SVA感染性克隆并表达外源基因已开展了大量研究。例如,LIU等[16]构建的绿色荧光蛋白标记SVA重组病毒,并以此作为工具用于中和抗体的检测及筛选抗病毒药物;宋高媛等[17]构建了一种嵌合FMDV抗原表位的重组SVA毒株,该重组病毒具有与亲本病毒相似的增殖特性,并且有较高的遗传稳定性。本实验室前期利用反向遗传操作技术构建了一种能够稳定表达NLuc荧光素酶的SVA-Nluc重组报告病毒,它能够快速检测SVA的中和抗体效价,高通量筛选SVA特异性抗病毒因子[13]。以上结果表明SVA作为载体具有容纳一定外源基因的能力。

GM-CSF细胞因子是一种活跃的免疫效应因子,在体内有着广泛的免疫活性,作为免疫佐剂,它不仅可以促进APC(antigen presenting cell)的成熟,提高其抗原提呈能力,而且在抗肿瘤免疫中扮演着关键性作用[18]。近年来,学者们尝试将GM-CSF作为外源基因插入病毒疫苗载体序列中,以提高疫苗的免疫效果。ZHOU等[19]构建了表达犬GM-CSF的重组减毒狂犬病疫苗,结果表明,重组病毒可激活外周血中更多的DC和B细胞,并且能产生较高的中和抗体水平。虞凌雪[20]构建了表达猪GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株,动物试验表明重组病毒PRRSV抗体水平显著高于亲本疫苗病毒免疫组,且重组病毒免疫组诱导活化的CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞比例均显著高于亲本疫苗毒免疫组。GUO等[21]构建了表达鸡粒细胞-巨噬细胞的重组新城疫(NDV)病毒,研究表明重组病毒可有效提高NDV特异性抗体滴度。以上研究结果表明,嵌合GM-CSF疫苗株可有效提高毒株的特异性和中和抗体水平,提高机体免疫应答能力。

为了更好地提高SVA灭活苗的免疫水平,本研究在SVA反向遗传操作平台的基础上,构建能够稳定表达猪源GM-CSF的重组病毒rSVA-GM-CSF,该病毒具有与亲本毒相似的增殖特性,且具有良好遗传稳定性,可作为提高机体免疫水平的新型疫苗备选株,为在机体内对重组病毒rSVA-GM-CSF进行免疫效力评价奠定了基础。