邓 倩,王奕凯,张思邈,尉啸涵,郭大伟,刘晓晔,*,董 虹,*

(1.北京农学院 动物科学技术学院 兽医学(中医药) 北京市重点实验室,北京102206;2.北京农学院 动物科学技术学院 北京市中兽药工程技术研究中心,北京 102206)

大肠杆菌是临床上最常见的一种革兰阴性菌,能引起多种动物病理性感染[1]。有研究表明,大肠杆菌可以引起家禽群的局部或全身感染以及引起全身性急性奶牛乳房炎,能够破坏仔猪肠道屏障进而降低断奶仔猪的生长性能,同时也是引起人类腹泻的主要原因之一[2-5]。因此,大肠杆菌感染给养殖业和人类健康造成巨大的经济损失和生命安全威胁。

大肠杆菌可以损伤肠道屏障,ZO-1经常被用于评估肠道屏障的损伤程度,也是肠道屏障紧密连接的一个主要标记蛋白[6-7],起着维持整个细胞通透性的作用[8-9]。当ZO-1表达降低时,提示细胞屏障可能遭到破坏,与此同时,细菌和细菌毒力因子也更容易进入到细胞内造成进一步的损伤。所以,当受到大肠杆菌感染时,恢复ZO-1的正常表达对肠道屏障功能至关重要。

清热凉血方是由2味及2味以上单味药组成的方剂,广泛的作用靶点是相比于其他药物所具有的独特优势之一[10-11]。清热凉血方讲究的是“扶正”和“祛邪”,一方面可以通过靶向细菌产生抗菌作用,同时也可以通过靶向宿主产生抗菌作用,双效齐下,恢复机体阴阳平衡[12]。清热凉血方是否可以防治大肠杆菌引起的紧密连接ZO-1蛋白损伤目前尚不清楚。

本研究探究清热凉血方对大肠杆菌的直接抑菌作用以及大肠杆菌对紧密连接ZO-1蛋白损伤的防治作用。此外,还进一步检测了清热凉血方中含有的有效活性成分,为下一步对清热凉血方抗菌的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细菌和细胞大肠杆菌(ATCC25922)和IPEC-J2均来自本实验室自行冻存。所有细胞和细菌均在含有5% CO2的37℃培养箱中培养。

A.白头翁汤;B.牛角地黄汤;C.清营汤;D.清瘟败毒饮

A.清热凉血方预防处理后ZO-1表达变化;B.清热凉血方治疗处理后ZO-1表达变化。 ns.P>0.05;*.P<0.05;**.P<0.01。下同

A.细胞荧光拍摄结果;B.ZO-1蛋白荧光强度量化

1.2 主要试剂及药材改良马丁培养基(生产批号:02-037)购自北京奥博星生物技术有限责任公司;硝酸铝(货号:A800886)、三氯化铁(货号:I811935)、苯酚(货号:P815401)购自上海麦克林生化科技有限公司;ZO-1 Monoclonal Antibody(货号:339188)购自ThermoFisher公司;2xReal-time PCR Super Mix(货号:MF013-01)购自北京聚合酶生物科技有限公司;白头翁(生产批号:20201223)、黄连(生产批号:2105202)、黄柏(生产批号:210505001)、生地(生产批号:B7291411)、水牛角(生产批号:B8051441)、甘草(生产批号:200516)购自北京同仁堂。

1.3 清热凉血方水提液制备制备4付清热凉血方水提液。4付清热凉血方组成如图1所示,白头翁汤:白头翁6 g、黄连9 g、黄柏9 g、秦皮9 g;牛角地黄汤:水牛角30 g、生地24 g、芍药9 g、丹皮6 g;清营汤:水牛角9 g、生地15 g、玄参9 g、麦冬9 g、连翘6 g、金银花9 g、黄连5 g、竹叶3 g、丹参6 g;清瘟败毒饮:石膏30 g、知母12 g、甘草12 g、水牛角6 g、生地6 g、芍药12 g、牡丹皮12 g、黄连3 g、黄芩12 g、连翘12 g、栀子12 g、玄参12 g、竹叶12 g、桔梗12 g。按剂量配比好后,加入足量蒸馏水,浸泡30 min。用武火煮沸后改为文火继续煎煮20 min,使用4层纱布趁热过滤后收集药液。继续向剩余的药渣加入足量蒸馏水,重复上述步骤1次,最后将2次所得的滤液合并,利用旋转蒸发仪将药液进行浓缩,使最后生药的质量浓度为1 g/mL。

1.4 菌液的制备将活化后的大肠杆菌菌液进行离心,弃掉上清液,用0.9%生理盐水重悬,使用比浊管进行细菌计数。使用时用培养基进行稀释备用。

1.5 最小抑菌浓度(MIC)测定采用试管法进行MIC测定。取40支试管,10支为1组进行编号。将药液以2倍稀释加入到1～8号试管,即质量浓度为1 000.000 0,500.000 0,250.000 0,125.000 0,62.500 0,31.250 0,15.625 0,7.812 5 g/L。再按1∶1加入浓度为2×105CFU/mL的菌液。第9号试管只加药,不加菌,用作药物对照。第10号试管只加菌,不加药,用作细菌对照。37℃恒温培养箱过夜培养。

1.6 IPEC-J2培养及分组使用细胞计数器将细胞密度调整为1×106个/孔,待细胞长到80%～90%开始试验。试验分为6组。空白对照组、大肠杆菌组、白头翁汤组、牛角地黄汤组、清营汤组和清瘟败毒饮组。预防处理时,空白对照组加入维持培养基(含2%血清的DMEM)作用16 h;大肠杆菌组加入维持培养基作用12 h,12 h后加以入大肠杆菌1×108CFUs/孔作用4 h;其余各组先加清热凉血方作用12 h,12 h后处理同大肠杆菌组。治疗处理时,空白对照组加入维持培养基作用16 h,大肠杆菌组和剩余其他组加入1×108CFUs/孔的大肠杆菌作用4 h,4 h后大肠杆菌组换成维持培养基作用12 h。其他各组加入对应清热凉血方作用12 h。

1.7 RT-qPCR反应将反应完成后的细胞用PBS清洗3次,使用TRIzol法提取细胞总RNA。按照Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR试剂盒说明书步骤逆转录合成cDNA。按2×Real-time PCR Super Mix试剂盒说明书步骤进行RT-qPCR。引物设计参考文献[13],具体见表1。

表1 RT-qPCR 引物

1.8 免疫荧光染色检测将反应完成后的细胞用PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定15 min,再用PBS清洗3遍,3% BSA室温孵育1 h进行封闭;封闭结束后直接孵育ZO-1荧光一抗3 h,再用PBS清洗3遍,孵育Actin 30 min,再用PBS清洗3遍,孵育DAPI 5 min,最后用PBS清洗3遍,封片,荧光显微镜拍摄。

1.9 活性成分含量测定精密称取芦丁、没食子酸、葡萄糖等标准品配置成质量浓度为0.2 g/L标准样品溶液。再将标准样品溶液进行不同质量浓度的稀释,于D510 nm、D760 nm以及D490 nm处测定吸光度值。分别以芦丁、没食子酸、葡萄糖标准品溶液质量浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。将清热凉血方稀释成20 g/L,按上述标准曲线制备方法进行测定,并由标准曲线或回归方程计算样品中总黄酮、总酚酸、总多糖含量[13-15]。

2 结果

2.1 清热凉血方对大肠杆菌MIC测定结果清热凉血方本身的颜色是影响MIC判断的主要原因,因此本试验在培养基中加入微量酚红(0.02%),通过细菌和清热凉血方共孵育后的颜色变化来确定MIC值。4付清热凉血方对大肠杆菌的MIC测定结果见表2,结果表明白头翁汤、牛角地黄汤和清瘟败毒饮对大肠杆菌的MIC最低,说明抑菌作用最强,其次是清营汤。

表2 4付中药复方水提取液对大肠杆菌的 MIC值 g/L

2.2 清热凉血方对ZO-1 mRNA表达的影响为了验证4付清热凉血方对ZO-1 mRNA表达的影响,使用RT-qPCR对ZO-1进行定量分析,结果如图2所示。在进行预防处理和治疗处理时,与空白对照组相比,大肠杆菌组中ZO-1 mRNA的表达显著降低(P<0.05),表明大肠杆菌能够对细胞造成损伤,说明造模成功;使用清热凉血方预防处理有助于细胞抵抗大肠杆菌的侵袭。其中牛角地黄汤效果最好(P<0.01),白头翁汤和清瘟败毒饮效果次之(P<0.05)(图2A)。说明牛角地黄汤对大肠杆菌的侵袭有很好的预防作用。攻菌后,再使用中药复方水提液有助于恢复ZO-1 mRNA的表达,牛角地黄汤和清瘟败毒饮效果最好(P<0.01),白头翁汤效果次之(P<0.05)(图2B)说明牛角地黄汤和清瘟败毒饮对大肠杆菌侵袭有很好的治疗作用。

2.3 清热凉血方预防处理对ZO-1蛋白表达的影响蛋白是mRNA转录和翻译后的产物,执行不同的细胞功能。于是将细胞制作成细胞爬片,待作用结束后进行固定和抗体孵育,使用激光共聚焦显微镜对ZO-1蛋白的荧光强度进行定量分析。结果表明,与空白对照组相比,大肠杆菌组中ZO-1 蛋白表达显著降低(P<0.05),说明造模成功;与大肠杆菌组比较,白头翁汤组、清营汤组和清瘟败毒饮组中ZO-1 蛋白表达显著升高(P<0.05)(图3A为荧光结果,图3B为结果量化);说明白头翁汤、清营汤和清瘟败毒饮可以通过保护细胞抗大肠杆菌对ZO-1的破坏。

2.4 清热凉血方治疗处理对ZO-1蛋白表达的影响探究大肠杆菌预处理4 h后4付清热凉血方对ZO-1蛋白表达的影响。结果显示,大肠杆菌组与空白对照组相比,大肠杆菌组中ZO-1 蛋白表达极显著降低(P<0.001),表明模型构建成功;其他用药组与大肠杆菌组比较,清瘟败毒饮组和牛角地黄汤组可以极显著恢复ZO-1蛋白的表达(P<0.01,P<0.001),而白头翁汤组和清营汤组与大肠杆菌组相比差异不显著(P>0.05);说明清瘟败毒饮和牛角地黄汤可以治疗大肠杆菌对ZO-1蛋白造成的损伤,并且清瘟败毒饮效果最好。

2.5 清热凉血方中有效活性成分含量的检测根据前期试验结果,为了进一步探究清热凉血方具有预防和治疗大肠杆菌损伤的原因。检测清热凉血方中是否含有具有抗菌、抗炎、免疫调节等药理作用的有效活性成分。通过硝酸铝显色法、硫氰化钾-三氯化铁法以及浓硫酸-苯酚法检测总黄酮、总酚酸、总多糖的含量。结果显示,白头翁汤、牛角地黄汤、清营汤和清瘟败毒饮中均含有一定量的总黄酮、总酚酸以及总多糖成分。其中,总黄酮和总酚酸含量最高的是白头翁汤,分别为120.75,58.11 mg/g;总多糖含量最高的是牛角地黄汤为370.02 mg/g(图5)。说明清热凉血方含有多种有效成分,不单单只通过一种成分来发挥预防和治疗作用。

3 讨论

随着抗生素的广泛使用,造成多重耐药(MDR)细菌的出现,因此,需要寻找新的抗菌策略[16]。天然植物中含有大量有效活性成分,具有多种生物活性[17]。研究发现,迷迭香提取物能够降低大肠杆菌攻毒肉鸡的腹泻率,从线叶金雀花中提取的总黄酮以及黄连、苏木、五味子的水提液对大肠杆菌都有很好的抑菌效果[18-22]。但在临床的应用中,中药复方的使用频率更高。中药复方具有一定结构、多层次、多作用靶点等特点。因此,本研究选取4付经典的清热凉血方进行探究,以期为临床治疗大肠杆菌用药提供参考。

清热凉血方由于具有颜色不利于对MIC的直接判断。本研究中使用加入微量酚红改良的马丁培养基,预先将清热凉血方调整至中性,细菌生长繁殖中消耗培养基中的葡萄糖,使溶液呈酸性,酚红在酸性环境中呈黄色来进行判定。试验结果表明,白头翁汤、牛角地黄汤、清营汤和清瘟败毒饮均有一定直接抗菌作用,其中抗菌效果最好的是清瘟败毒饮、白头翁汤和牛角地黄汤。

进一步地有研究表明,大肠杆菌在临床上主要引起犊牛、仔猪以及儿童腹泻,损伤肠道屏障[23-25]。紧密连接是肠道屏障最重要的一个组成部分。窦彩霞等[26]在研究中发现,肠产毒素大肠杆菌处理细胞可以极显著降低ZO-1的表达,引起细胞损伤,破坏紧密连接。因此,本研究聚焦于探究清热凉血方对大肠杆菌损伤细胞ZO-1的防治作用,同时,也证实了大肠杆菌标准株同样也能造成ZO-1表达的降低。

使用清热凉血方对细胞进行预防和治疗处理,再检测ZO-1 mRNA的表达和免疫荧光强度。结果表明,清热凉血方有很好的预防和治疗作用,其中预防作用最好的是白头翁汤、清营汤和清瘟败毒饮,治疗效果最好的是清瘟败毒饮。这与mRNA的表达并不完全相同。这可能是由于mRNA在转录和翻译的过程中发生了改变,研究表明蛋白是执行各种任务以维持生命的主力分子,所以蛋白最后的表达情况更具有参考价值[27]。并且在预防作用中,清热凉血方直接靶向细胞本身,通过增加细胞ZO-1的表达来抵抗大肠杆菌的侵袭,这与传统靶向细胞本身的抗菌方式有所区别,这也体现出清热凉血方具有“扶正和祛邪”优势[12]。

有效活性成分是清热凉血方能够发挥生物活性的最主要原因。分别检测4付清热凉血方中的总黄酮、总酚酸以及总多糖含量。结果表明,4付清热凉血方中均含有这3类有效活性成分,这也说明清热凉血方中含有大量不同种类的有效活性成分,这些有效活性成分相辅相成,最终起到抗大肠杆菌引起的ZO-1蛋白降低的作用。

根据以上结论可以得出,4付清热凉血方有直接抑菌作用,并且通过提高ZO-1蛋白的表达进而具有预防和治疗大肠杆菌损伤细胞作用。除此之外,清热凉血方中含有多种有效活性成分,所以发挥作用的机制可能是多方面的,具体还需更进一步研究。