张暖暖,宁夏青,艾丽平,孙 晨,张士霞

(河北农业大学 动物医学学院,河北 保定 071000)

自1987年法国首次在电视腹腔镜下成功完成了世界首例胆囊切除术以来[1],随着实验设备的迅速发展以及腹腔镜手术具有对机体损伤小、术后恢复快和伤口美观的优点,其在兽医临床上的应用逐步普及起来。腹腔镜手术中常用到的气体为CO2,CO2气体充入腹腔使腹内压升高,保持一定压力在封闭的腹腔内造成一种类似腹腔室隔综合征的现象,其对脏器的影响不容忽视。小肠微循环是末梢循环,对神经-体液调节极其敏感,CO2气腹引起腹内压的升高可使小肠黏膜的血流量减少,而气腹解除后小肠黏膜的灌注及供氧增加,引起小肠黏膜缺血再灌注。研究发现,CO2气腹引起的肠道损伤可能与炎症反应[2]和氧化应激引起的肠黏膜屏障功能损伤有关[3]。右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是临床麻醉中常用的一种药物,近年来研究显示,DEX在一定程度上可以减少各脏器的缺血再灌注损伤,对各脏器有显著的保护作用[4]。大量试验表明DEX可从缓解氧化应激、抑制炎性反应、减少细胞凋亡等多方面减少脏器损伤,但其对腹腔镜气腹所致肠损伤的预防保护机制还不是很清楚。因此,本研究旨在探讨DEX预处理对腹腔镜所致肠损伤的保护作用,并从氧化应激和炎性反应探讨其作用机制,为减轻兽医临床上腹腔镜手术引发的机体损伤提供新的干预方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂Sprang-Dawley(SD)大鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司;盐酸右美托咪定由上海源叶生物技术有限公司提供;总蛋白定量测定试剂盒、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;大鼠白细胞介素-6(IL-6)、大鼠白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒由北京冬歌博业生物技术有限公司提供;TransZol Up Plus RNA Kit由北京全式金生物技术股份有限公司提供;PrieScript RT Master Mix试剂盒、TB Green®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒由宝生物工程(大连)有限公司提供;β-actin一抗、HO-1一抗、Nrf2一抗、IKBα一抗、NF-κB一抗由沈阳万类生物科技有限公司提供,辣根过氧化物酶标记的二抗由北京中杉金桥生物技术有限公司提供;其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 分组与处理8周龄250～300 g SD大鼠,饲喂标准化大鼠鼠粮,饮水不限,饲养环境温度、湿度稳定。18只大鼠随机平均分为3组:假手术组(Sham)、CO2气腹组(CO2)、DEX预处理组(DEX)。CO2和DEX组气腹前30 min大鼠腹腔分别注射生理盐水(1 mL/kg)和DEX(50 μg/kg),气腹时对大鼠进行呼吸麻醉,待大鼠完全麻醉后将气腹针刺入大鼠腹腔后在2 kPa(15 mmHg)压力下维持90 min;Sham组除不给予腹腔压力外,其余操作同CO2组。气腹结束后6 h将大鼠在玻璃罩中呼吸麻醉后,处死大鼠并取回盲瓣以上2 cm处的回肠组织,一部分放入10%甲醛固定液中,用于病理切片制作;其余部分置于-80℃超低温冰箱用于后续试验的检测。

1.3 小肠组织病理形态学观察小肠组织于10%甲醛固定液中固定48 h后取出修剪成合适大小,流水冲洗24 h后,依次放入70%,80%,90%,95%,100%酒精中适当时间进行脱水,依次经过二甲苯透明、浸蜡、包埋处理、切片,HE染色后在光学显微镜下观察小肠组织形态并拍照评估损伤程度。

1.4 小肠氧化应激指标检测取-80℃超低温冰箱冻存的小肠组织0.1 g,按照1∶9的比例加入900 μL生理盐水后在匀浆机中制备10%的组织匀浆,4℃、2 500 r/min离心10 min,取上清,采用BCA法测定匀浆蛋白浓度,严格按照试剂盒注意事项和步骤测定小肠组织中MDA、GSH的含量变化。

1.5 小肠炎症水平检测小肠组织中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平用ELISA试剂盒双抗夹心法进行检测。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。同1.4测定大鼠小肠匀浆中蛋白浓度后,按照试剂盒说明检测MPO的活力。

1.6 小肠紧密连接蛋白相关基因 mRNA的检测采用实时荧光定量法测定紧密连接基因ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA的相对表达。按照TransZol Up Plus RNA Kit试剂盒说明书提取小肠组织总RNA。按照PrieScript RT Master Mix试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。按照TB GreenRPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明用LightCyclerR96仪器进行实时荧光定量PCR。扩增条件:95℃ 30 s预变性;95℃ 5 s变性,60℃ 30 s退火延伸,40个循环。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成(表1)。采用2-△△Ct方法分析相关mRNA的相对表达量。

表1 基因序列

1.7 小肠组织相关蛋白表达的检测采用Western blot检测小肠组织HO-1、Nrf2、IKBα和NF-κB蛋白的相对表达量。取小肠组织100 mg加入900 μL RIPA裂解液提取组织蛋白,BCA法检测蛋白浓度并调节蛋白浓度为一致后,水浴10 min使蛋白变性。选择合适浓度的SDS-PAGE胶电泳分离蛋白,电泳结束电转至NC膜,37℃封闭1 h,β-actin(1∶500)、HO-1(1∶500)、Nrf2(1∶500)、IKBα(1∶500)、NF-κB(1∶500)孵育一抗并4℃过夜,洗膜后按1∶6 000孵育二抗,再次洗膜后用ECL发光液进行化学发光,最后用Image J软件扫灰度值并数据分析。

2 结果

2.1 大鼠小肠病理学形态观察结果小肠光学显微镜观察结果显示,Sham组(图1A)小肠上皮细胞形态正常,肠绒毛排列紧密有规则;CO2组(图1B)肠黏膜上皮细胞完整性被破坏,组织结构紊乱,腺体受损,肠绒毛严重变形界限模糊且伴有炎性细胞浸润现象; DEX组(图1C)小肠上皮细胞少量腺体受损,肠绒毛排列杂乱仅部分脱落,整体损伤程度较CO2组有所缓解。

A.Sham组;B.CO2组;C.DEX组

2.2 小肠氧化应激指标水平变化小肠氧化应激指标测定结果显示,与Sham组相比,CO2组MDA含量极显著升高(P<0.01),DEX组MDA含量显著升高(P<0.05);与CO2组相比,DEX组MDA含量极显著下降(P<0.01)(图2A)。与Sham组相比,CO2和DEX组GSH含量极显著降低(P<0.01);与CO2组相比,DEX组GSH含量极显著升高(P<0.01)(图2B)。

A.大鼠小肠组织中MDA含量;B.大鼠小肠组织中GSH含量

2.3 小肠炎症因子水平变化小肠炎症水平测定结果显示,与Sham组相比,CO2组小肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均极显著升高(P<0.01),DEX组IL-6水平显著升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均极显著升高(P<0.01);与CO2组相比,DEX组IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均极显著降低(P<0.01)(图3)。

A.小肠组织IL-6水平;B.小肠组织IL-1β水平;C.小肠组织TNF-α水平;D.小肠组织MPO活力

2.4 小肠紧密连接蛋白相关基因的变化小肠紧密连接蛋白相关基因mRNA测定结果显示,与Sham组相比,CO2和DEX组小肠组织ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相对表达量均极显著降低(P<0.01);与CO2组相比,DEX组ZO-1、Occludin、Claudin-1的mRNA相对表达量均极显著升高(P<0.01)(图4)。

A.小肠组织ZO-1 mRNA的表达;B.小肠组织Claudin-1 mRNA的表达;C.小肠组织Occludin mRNA的表达

2.5 小肠相关蛋白相对表达量的变化Western blot结果表明,与Sham组相比,CO2组小肠组织HO-1、Nrf2、IKBα和NF-κB蛋白表达量均极显著升高(P<0.01),DEX组HO-1、Nrf2蛋白表达量极显著升高(P<0.01),IKBα蛋白表达量极显著升高(P<0.01),NF-κB蛋白表达量显著升高(P<0.05);与CO2组相比,DEX组HO-1、Nrf2蛋白表达量进一步极显著升高(P<0.01),IKBα蛋白表达量极显著降低(P<0.01),NF-κB蛋白表达量显著降低(P<0.05)(图5)。

3 讨论

肠黏膜屏障由机械屏障、生物屏障、化学屏障和免疫屏障组成,是一个极其复杂的体系,能够保护机体免受外来细菌毒素的入侵。其中肠黏膜机械屏障也称为物理屏障,作为肠道的第一道防线,在维持肠道正常生理功能中发挥着不可或缺的作用。有研究发现,CO2气腹可导致肠黏膜屏障受损,发生细菌易位,继而导致其他远隔器官受损。肠上皮细胞及其紧密连接是肠黏膜机械屏障的主要组成部分。ZO-1、Claudin-1和Occludin是胃肠道中紧密连接的3个关键蛋白[5],成为了近年来肠黏膜屏障的研究热点,并发现其在肠道中很多至关重要的作用。本试验显示CO2气腹可导致小肠上皮细胞完整性被破坏,且有炎性细胞浸润现象,小肠紧密连接蛋白 ZO-1、Claudin-1和Occludin mRNA的相对表达量极显著降低,而DEX预处理后的mRNA的相对表达量均显著回升,该结果说明CO2气腹破环了小肠机械屏障,且DEX预处理可有效调节小肠上皮柱状细胞的规则排列,使上皮细胞紧密连接蛋白的正常表达,达到保护小肠发挥其正常生理功能的效果。

肠黏膜机械屏障功能导致损伤可引起肠道有害细菌和内毒素入侵并引起机体一系列的病理反应,如机体氧化应激以及其他病理状态等。Nrf2作为一种重要的内源性抗氧化应激调控因子,可诱导其下游调控基因血红素加氧酶-1(HO-1)等抗氧化酶的表达增加[6],此诱导表达近年来被认为是细胞内最重要的抗氧应激化机制之一[7],Nrf2和HO-1的表达变化可引起其下游氧化应激指标ROS、SOD、MDA等的表达变化[8]。MDA是脂质过氧化反应的终产物,常作为衡量组织氧化应激损伤程度的指标之一[9]。HO-1是Nrf2的靶基因,能够诱导血红素以及活性氧(ROS)还原而抑制氧化应激。大量试验表明[10-13],腹腔镜气腹过程中会引起机体的氧化应激反应并产生大量的ROS,激活氧自由基和抗氧化物信号。而谷胱甘肽(GSH)在肠道内含量丰富,是小肠抗氧化系统的关键还原剂[14],肠道的抗氧化能力可由其含量变化直接反应。与张蕾等[15]、张建涛等[13]研究结果一致,本试验结果显示,CO2组小肠组织中Nrf2和HO-1蛋白表达极显著升高,表明腹腔镜气腹引起了大鼠小肠的抗氧化应激反应,使MDA含量升高、GSH含量降低,引起大鼠小肠严重的氧化应激,DEX预处理后小肠组织中Nrf2和HO-1蛋白表达进一步升高,MDA含量降低、GSH含量回升,小肠氧化应激损伤得到明显改善,说明CO2气腹可激活Nrf2/HO-1通路,DEX可通过减轻小肠氧化应激从而达到保护机体的作用。

此外,HO-1能够抑制NF-κB 表达与活化,从而间接抑制机体炎症反应[16]。NF-κB作为重要的基因转录因子之一,随着其结构和功能的研究不断深入,发现NF-κB信号转导途径的激活是引发肠道炎症的关键环节[17]。气腹引起的缺血再灌注过程可导致组织内皮细胞损伤[18],并会诱发一系列的炎症级联反应,进一步刺激趋化因子和炎症介质的分泌[19]。NF-κB通路中的3个关键因子为IKKβ、IKBα和NF-κB。NF-κB未被激活时与IkB相结合形成三聚体位于细胞质中,在某些刺激因素作用下NF-κB与IkB解离,导致NF-κB的过度激活,被激活后可调节基因的转录,进而促进各种炎症因子的产生,如TNF-α、白细胞介素(interleukin,IL)系列、急性期反应蛋白等[20]。王杏等[21]的研究发现当细胞受到刺激时可激活IKKβ,经一系列反应导致IKBα泛素化,NF-κB游离,细胞核内NF-κB增多,启动下游炎症反应和下游通路。很多研究表明,NF-κB均参与到缺血再灌注引起的机体损伤中[13,22]。因此,气腹引起的机体炎性反应不可忽视。MPO作为中性粒细胞的激活标志和功能标志,其活性变化可反映嗜中性多形核白细胞(PMN)的功能和活性状态。研究显示,MPO的活性与中性粒细胞计数之间存在极显著相关性,可间接反应组织的局部炎症和损伤程度[23]。王永东等[24]、陈亚萍等[25]的研究发现DEX均可通过抑制炎性反应达到保护肠黏膜的作用。本试验显示CO2组肠组织IKBα和NF-κB蛋白表达升高,IL-6、IL-1β、TNF-α水平和MPO活力均升高,DEX预处理后分别不同程度上减轻以上因子的表达,提示DEX可能通过NF-κB信号通路减缓气腹导致的肠炎性损伤。

综上所述,CO2气腹能引起小肠发生氧化应激、炎性反应进而引起小肠黏膜机械屏障损伤,DEX能通过降低机体氧化应激、减轻炎症因子的释放、改变紧密连接蛋白基因的表达等途径缓解气腹对机体的损伤,其减轻损伤的机制可能与NK-κB信号通路及Nrf2/HO-1通路有关。