唐远谋,拉普莫拉子,刘洋,王娟,徐纲,肖迪,刘达玉,肖龙泉*

(1.成都大学 食品与生物工程学院,成都 610106;2.宜宾市娥天歌食品有限公司, 四川 宜宾 644100;3.重庆市计量质量检测研究院,重庆 400020)

豆酱是我国传统的发酵调味品,有黄豆酱、豆面酱、豆瓣酱等多种类型,其以霉菌、酵母菌等微生物为发酵菌种,经过预处理、制曲、发酵等工艺酿造而成,发酵过程中将原料中的营养成分降解成可消化的氨基酸、肽类等小分子物质,在菜肴烹饪过程中可使菜品呈现出更加鲜美的滋味[1-2]。

苦荞因富含微量元素和多种功能性营养成分[3-4]而被广泛应用在复合型食品加工领域,开发的苦荞系列产品受到越来越多消费者的欢迎,但是关于苦荞豆酱的报道较少见。鲁氏酵母是一种常见的嗜高渗透压、能够在高盐环境中生长的酵母菌,最适生长温度为28～30 ℃,最适生长pH值为4～5[5]。酵母通过降解淀粉质原料产生糖类等营养物质,再代谢产生乙醇,并同时产生高级醇和芳香杂醇类副产物,且可以与豆酱中其他微生物代谢产酸,发生酯化反应并形成酯类物质,对豆酱的香气形成具有十分重要的作用[6]。基于此,将苦荞和大豆复合,接种鲁氏酵母和米曲霉用于苦荞豆酱的生产工艺,丰富了豆酱发酵原料,提升了苦荞黄豆酱的品质。研发的苦荞豆酱产品既有豆酱特有的风味,又兼具苦荞的营养保健功能,对提高人民健康水平具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄豆、面粉、苦荞:购于成都沃尔玛超市;米曲霉3.042、鲁氏酵母:山东和众康源生物科技有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻苯二甲酸氢钾(均为分析纯):成都市科隆化学品有限公司。

1.2 主要仪器与设备

PDMS/DVB萃取头、HP-5MS色谱柱、Agilent 7000D三重四级杆气质联用仪 美国安捷伦科技有限公司;HZ85-2磁力搅拌机 北京中兴伟业仪器有限公司;PHS-2F pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 苦荞黄豆酱制作工艺流程及操作要点

1.3.1.1 苦荞黄豆酱制作工艺流程

大豆→浸泡→蒸煮→拌苦荞粉→接种→制曲→加盐水拌匀→装罐发酵→后期成熟→成品。

1.3.1.2 苦荞黄豆酱操作要点

浸泡大豆:将颗粒饱满的大豆洗净,放入容器内浸泡8 h左右,大豆与水的质量与体积比为1∶3,再将其沥干备用。

蒸煮:用蒸锅蒸煮45 min,蒸至大豆熟透而不烂,用手捻时皮可以轻易脱落。

拌粉:用多功能粉碎机将购买的苦荞麦粉碎至粉状,将冷却至45 ℃的大豆与苦荞粉按质量比4∶1(干豆∶苦荞粉)混合。

人工接种:待拌好的大豆温度冷却至45 ℃时进行接种,米曲霉和鲁氏酵母的接种量均为干黄豆质量的0.04%。在相同的实验条件下,设置接种鲁氏酵母组、同时接种米曲霉和鲁氏酵母组。

制曲:将接种好的曲料放入恒温培养箱中培养,将培养温度调节至35 ℃,并在每组黄豆上铺一层纱布,每10 h给黄豆隔纱布喷水,保持一定的湿度并同时翻曲,增加空隙,保持通风,调控品温,防止温度升高引起的烧曲或杂菌污染。

加盐水装罐:在培养箱中培养72 h后,将黄豆和盐水(浓度为10%,质量与体积比)按1∶1加入已用沸水煮过10 min的玻璃罐中。

1.3.2 蛋白酶活力的测定

参照SB/T 10317-1999 《蛋白酶活力测定法》测定[7]。

1.3.3 氨基酸态氮含量的测定

参照GB 5009.235-2016中的电位滴定法测定[8]。

1.3.4 总酸的测定

参照GB/T 12456-2008中的方法进行测定[9]。

1.3.5 挥发性风味化合物分析鉴定

参照许春艳等[10]的实验方法,在苦荞豆酱发酵的第28天,称取5.0 g样品置于顶空瓶中,同时加入1.0 g NaCl用于离子强度调节;样品中的挥发性物质富集提取采用65 μm PDMS/DVB萃取头,萃取时间为40 min,萃取温度为50 ℃;萃取后在气相色谱仪进样口解吸5 min,进行后续GC-MS分析。

气相色谱(GC)条件:采用HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),氦气(He)作为载气,流速为1.0 mL/min,采用不分流模式进样;进样口温度250 ℃。程序升温为40 ℃保持3 min,以5 ℃/min升至100 ℃,再以6 ℃/min升至220 ℃,保持10 min。

质谱(MS)条件:电离方式为电子电离源(EI),电离电压为70 eV;离子源温度为230 ℃,四级杆温度为150 ℃;在35～400 u范围内全扫描。

采用美国国家标准与技术研究院NIST08谱库检索进行挥发性化合物的定性分析,保留匹配度大于750的化合物。

2 结果与分析

2.1 鲁氏酵母的添加对制曲过程中蛋白酶活力的影响

由图1可知,在制曲阶段,仅接种鲁氏酵母组蛋白酶活力始终低于接种米曲霉和鲁氏酵母组,这是由于米曲霉具有较强的产蛋白酶能力,从而导致两组样品的酶活力差异较大。在仅接种鲁氏酵母组中,因未接入米曲霉菌种,碳源消耗相对缓慢,随着制曲时间的增加,其蛋白酶活力增速相对稳定。当制曲时间为12 h时,接种米曲霉和鲁氏酵母组的蛋白酶活力出现大幅度上升,随后增速变慢,这可能是碳源消耗导致米曲霉活力下降。蛋白酶可使蛋白质水解成氨基酸,增加氨基酸态氮含量,因此同时添加鲁氏酵母和米曲霉有助于加速制曲进程,减少制曲时间。

图1 蛋白酶活力随制曲时间增加的变化Fig.1 Change of protease activity with the increase of koji-making time

2.2 总酸含量随发酵时间增加的变化

由图2可知,随着发酵时间的增加,两组样品的总酸含量均呈上升趋势,这是产酸微生物如乳酸杆菌的生长所致,安飞宇等[11]对自然发酵豆酱中微生物多样性进行分析,发现在属水平上,优势细菌主要为乳酸杆菌属和四联球菌属。接种米曲霉和鲁氏酵母组的苦荞黄豆酱在发酵前3 d总酸含量更高,这可能是由于鲁氏酵母与米曲霉生长增加了耗氧量,兼性厌氧菌乳酸菌大量繁殖,从而导致总酸含量更高;但在发酵4 d以后,接种鲁氏酵母和米曲霉组的总酸含量相对更低,这可能是微生物群落变化所致。

图2 总酸含量随发酵时间增加的变化Fig.2 Change of total acid content with the increase of fermentation time

2.3 氨基酸态氮含量随发酵时间增加的变化

由图3可知,在整个发酵过程中,接种鲁氏酵母和米曲霉组的氨基酸态氮含量明显高于仅接种鲁氏酵母组,氨基酸态氮主要来源于蛋白质的降解,结合图1可知,在制曲阶段接入米曲霉后,曲的蛋白酶活力明显升高,利于发酵过程中氨基酸态氮的生成。在发酵第13天时,仅接种鲁氏酵母组的氨基酸态氮含量仅为1.02 g/100 g,而接种鲁氏酵母和米曲霉组的氨基酸态氮含量高达1.27 g/100 g。在发酵第13～14天,氨基酸态氮含量未增加,这可能与蛋白酶或蛋白质的消耗相关。

图3 氨基酸态氮含量随发酵时间增加的变化Fig.3 Change of amino acid nitrogen content with the increase of fermentation time

图4 自然接种鲁氏酵母的苦荞黄豆酱气相色谱-质谱总离子流图Fig.4 Total ion flow diagram of tartary buckwheat soybean paste naturally inoculated with Saccharomyces rouxii by gas chromatography-mass spectrometry

图5 接种米曲霉和鲁氏酵母的苦荞黄豆酱气相色谱-质谱总离子流图Fig.5 Total ion flow diagram of tartary buckwheat soybean paste inoculated with Aspergillus oryzae and Saccharomyces rouxii by gas chromatography-mass spectrometry

2.4 鲁氏酵母的添加对苦荞黄豆酱挥发性成分的影响

将所检测到的挥发性成分分为7大类:醇类、酯类、酸类、酚类、醛类、酮类和其他化合物。由表1可知,在这两组样品中,共检测出48种挥发性物质。只接种鲁氏酵母的苦荞黄豆酱样品共检测出挥发性香气成分30种,包括9,10-十八碳二烯酸甲酯等13种酯类、3-(4-甲氧基苯基)-3-硒醇等5种醇类、3,4-二羟基-3,4-二甲基-2,5-己二酮等2种酮类、醛类1种(二甲醇缩甲醛)、酸类1种(乙酸)、酚类1种(麦芽酚)、N-甲基吗啉氧化物等7种其他化合物。接种米曲霉和鲁氏酵母的苦荞黄豆酱样品检测出挥发性成分31种,包括12,13-十八碳二烯酸甲酯等8种酯类、3-(4-甲氧基苯基)-3-硒醇等6种醇类、2-甲基-3-甲氧基-4H-吡喃-4-酮等3种酮类、醛类1种(α-亚乙基-苯乙醛)、酚类1种(麦芽酚)、酸类1种(α-亚乙基-苯乙酸)、1-异硫氰酸-2-甲氧基乙烷等11种其他化合物。

表1 不同样品中挥发性成分Table 1 Volatile components in different samples

酯类化合物是豆酱香气成分最主要的贡献物质,其不仅可以增强其他风味化合物的气味,而且可以为豆酱提供甜香和果香等风味感官特征,主要来源于酵母酶的催化合成,其次来源于有机酸和醇的酯化反应合成[12],可以缓和酱的咸味,且可以在一定程度上抑制黄豆酱中的不良、刺激性气味。乙酸乙酯、棕榈酸乙酯在两组样品中均被检测出,研究发现乙酸乙酯是清香型白酒的主要呈香物质且主要由生香酵母产生[13-14];棕榈酸乙酯具有陈油香气,味醇甜且浓,可以增加食品的醇厚感[15]。此外,具有芳香味的乙酸甲酯、乙酸异戊酯仅在接种米曲霉和鲁氏酵母组中检测到,乙酸异戊酯具有香蕉和梨的气味。

醇类可以赋予豆酱特殊的香气,也可以为酯化反应生成酯类物质提供底物,鲁氏酵母可以在无氧发酵条件下代谢产生醇类物质[16],发酵中后期倒酱频率和温度下降有利于酯类的生成[17]。在两组样品中均检测到1-辛烯-3-醇,这种物质为黄豆酱提供了蘑菇香味[18];而在添加鲁氏酵母和米曲霉组中发现了环辛醇,说明这是由米曲霉产生的挥发性化合物。

醛、酮类物质在两组样品中均被检测到,但其组成差异较大,这可能是微生物群落差异造成的;3-辛酮仅在接种米曲霉和鲁氏酵母组中检测到,它是一种具有果实香味的酮类化合物,在鸡枞子实体中含量较丰富[19]。在两组样品中均检测到乙酸,可能是乳酸菌等产酸微生物将糖类物质分解成乙酸。其他化合物中主要成分是含氮、含硫化合物,值得注意的是,吡嗪类化合物具有特殊香气,其阈值较低,具有类似烤肉、炒坚果的香味[20],对食品风味的贡献不容忽视,仅接入鲁氏酵母组中检测到吡嗪类化合物。

两组间挥发性成分种数相差不大,但其风味成分组成差异较大。在苦荞豆酱制备过程中,仅接入鲁氏酵母利于酯类化合物的生成,而接入鲁氏酵母和米曲霉利于含硫、含氮化合物的生成。

3 结论

在制曲阶段,接种米曲霉和鲁氏酵母有利于加速提升蛋白酶活力。在酱醪发酵阶段,接入米曲霉和鲁氏酵母组的氨基酸态氮含量明显高于鲁氏酵母组。两组样品中挥发性物质种数差异不大,但其组成成分存在明显不同,仅接入鲁氏酵母的苦荞豆酱中独有的2-甲基丁酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、十五碳酸乙酯等风味成分赋予了豆酱独特的风味;接入鲁氏酵母和米曲霉组中,酯类物质种数相对较少,但其含氮、含硫化合物种数明显增多。