姜舒,王飞,2,王旭峰,熊涵铮,彭楠,赵述淼,胡咏梅*

(1.华中农业大学 生命科学技术学院,武汉 430070;2.湖北省普林标准技术服务有限公司,武汉 430056)

豆豉是以黄豆或黑豆为主要原料,经微生物发酵而成的一种传统发酵食品[1]。豆豉的风味独具特色,不仅可作为调味品,而且可入药[2-3]。豆豉中含有丰富的生理活性物质,如大豆异黄酮[4]、γ-亚麻酸[5]、豆豉纤溶酶(Douchi fibrinolytic enzyme,DFE)[6]、血管紧张素转移酶抑制肽[7]等,能够有效地预防心脑血管疾病,具有较高的食用价值和药用价值,深受广大消费者喜爱。

按照参与发酵的微生物的不同,可将豆豉分为曲霉型、毛霉型、根霉型及细菌型豆豉[8]。豆豉的生产主要分为制曲和发酵两大工序[9]。制曲的目的是以黄豆或黑豆为原料,在一定条件下积累霉菌或细菌等微生物的菌体及其所产生的酶。出曲后,拌入食盐、酒等辅料,进入发酵阶段,再以分泌的蛋白酶、淀粉酶等将大豆中的大豆蛋白、淀粉等大分子物质降解为小分子的肽、氨基酸、还原糖等[10]。同时,酵母、乳酸菌等风味菌也参与了豆豉风味的形成[11]。

在豆豉的后发酵阶段,豆豉中的食盐起到了抑制发酵微生物的生长繁殖、保障安全发酵、赋予豆豉风味的作用[12]。然而,研究发现食盐摄入量过高会引发高血压、冠心病等多种疾病[13]。作为百姓常用的调味品,豆豉中的盐含量也让人担忧。减盐、轻盐调味品是降低食盐中钠摄入的重要途径。随着“低盐”、“减盐”等健康概念的普及,降低调味品中的盐度是近几年调味品的大趋势[14-15]。此外,也有研究表明在发酵过程中减盐会降低微生物的渗透压,有利于氨基酸态氮、氨基酸和挥发性风味化合物的积累[16]。目前,豆豉中的盐含量多在12%左右[17]。本文研究了7%、9.5%、12%的盐度对曲霉型豆豉发酵理化性质的影响,以期为低盐豆豉的开发生产与质量控制提供技术指导和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 发酵菌种、原料与试剂

米曲霉孢子粉(曲精):购自山东济宁玉园生物科技有限公司。黄豆、食盐、米酒、白酒:均为市售。甲醛、氢氧化钠、浓盐酸、磷酸、碳酸钠、三氯乙酸、十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠、硼酸、硼酸钠、酪素、L-酪氨酸、DNS等化学试剂:均为分析纯,均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

PL303电子分析天平、101型电热恒温鼓风干燥箱、通风曲床、HH-4数显恒温水浴锅、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、721型光光度计、HJ-5多功能搅拌器等。

1.2 试验方法

1.2.1 豆豉的生产工艺流程

黄豆→筛选→浸泡→蒸煮→冷却→接种、制曲→拌食盐、米酒、白酒后入缸,水浴保温发酵→检验、包装→成品。

将去除杂质的黄豆采用30 ℃水温浸泡1.5 h后沥干,蒸汽常压蒸煮3 h。出料后,按万分之二加入米曲霉曲精,拌和均匀,在通风曲床上维持30～35 ℃品温制曲46 h,期间翻曲2次。出曲后,分为3组,分别按7%、9.5%、12%加入食盐,每组按2%加入米酒和白酒,拌和均匀,使食盐和水分均匀渗入豆豉曲胚内部。待曲胚充分拌和均匀后,入陶缸,水浴40～55 ℃保温发酵,后发酵20 d[18-19]。

1.2.2 总酸和氨基酸态氮含量的测定

总酸和氨基酸态氮的测定采用酸碱滴定法[20]与甲醛滴定法[21]。首先称取5 g试样,研碎后加入到100 mL容量瓶中,加蒸馏水定容至100 mL,以8 000 r/min离心10 min。吸取上清液10.0 mL置于200 mL的烧杯中,加入60 mL的蒸馏水,开动磁力搅拌器,用0.1 mol/L NaOH标准滴定溶液滴定至酸度计指示pH为8.2,记下消耗NaOH标准滴定溶液的体积,计算总酸含量。然后加入10.0 mL甲醛溶液,混匀,再用0.1 mol/L NaOH标准滴定溶液继续滴定至pH为9.2,记下消耗NaOH标准滴定溶液的体积,计算氨基酸态氮含量。以蒸馏水为空白对照试样,氨基酸态氮的计算公式如下:

式中:X表示试样中氨基酸态氮的含量,g/100 g;V1表示滴定用试样稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,mL;V2表示试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积,mL;c表示氢氧化钠标准滴定溶液的浓度,mol/L;V3表示试样稀释液取用量,mL;0.014为与氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=0.050 mol/L]相当的氮的质量,g。

1.2.3 蛋白酶酶活的测定[22]

酪氨酸标准曲线的绘制:分别吸取0,10,20,30,40,50 μg/mL的酪氨酸标准溶液1.00 mL,加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂1.00 mL,置于(40±0.2) ℃的水浴中显色20 min后,采用10 mm比色皿,采用分光光度计在680 nm波长处进行比色,以不含酪氨酸的零管为空白管调零,测定其吸光度值。以吸光度值为纵坐标,酪氨酸浓度为横坐标,绘制标准曲线并计算回归方程。

酶液的制备:准确称取1.000 g试样,加少量的相应缓冲液,充分研磨,转入100 mL容量瓶中,稀释至刻度后,用4层纱布过滤,取滤液待测。

样品的测定:先将10 g/L酪素溶液在(40±0.2) ℃的水浴中预热。取4支试管,各加1.00 mL待测酶液。取1支作为空白管,加2.00 mL三氯乙酸;其他3管作为测试管,各加入1.00 mL预热的酪素溶液,摇匀后于(40±0.2) ℃的水浴中保温10 min。取出试管,在3支测试管中分别加入2.00 mL三氯乙酸,在空白管中加入1.00 mL预热的酪素溶液,静置10 min后过滤。再各取滤液1.00 mL,加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5.00 mL、福林试剂1.00 mL,置于(40±0.2) ℃的水浴中显色20 min后,采用10 mm比色皿,采用分光光度计在680 nm波长处进行比色,以空白管调零,测定其吸光度值。

酶活的定义:1 g试样在40 ℃(酸性pH 3.0、中性pH 7.5、碱性pH 10.5)的条件下,1 min水解酪素产生1 μg 酪氨酸为一个酶活力单位。

1.2.4 氨基酸含量的测定

试样送至农业部微生物产品质量监督检验测试中心(武汉)进行氨基酸分析检测。

1.2.5 数据处理及统计分析

试验数据用Excel 2007 进行整理,使用SPSS对数据进行统计分析,使用Origin 8.6 和Adobe Illustrator CS3作图。

2 结果与分析

2.1 不同盐度对豆豉发酵过程中蛋白酶酶活的影响

由图1中A可知,在制曲阶段,曲料中的酸性蛋白酶酶活先升后降,在18 h时达最高,30 h后降低幅度不明显;中性蛋白酶酶活在12～30 h内增加迅速,30 h时最高,是酸性蛋白酶的3.3倍;碱性蛋白酶酶活一直呈逐渐升高的趋势。适宜的制曲时间为30～42 h。

图1 豆豉发酵过程中蛋白酶酶活的变化Fig.1 Change of protease activity during the fermentation of fermented soybeans

由图1中B～D可知,在后发酵阶段,随着盐的加入,3种蛋白酶酶活均呈下降趋势,其中4 d时酶活下降明显;4～16 d,在3种盐度的豆豉中中性蛋白酶酶活无明显下降,尤其是7%盐度的豆豉中一直维持着较高的蛋白酶酶活水平;至20 d时,在9.5%和12%盐度的豆豉中几乎检测不出酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活。总体看来,在后发酵期间,7%盐度远远高于12%盐度豆豉中的蛋白酶酶活。

2.2 不同盐度对豆豉发酵过程中氨基酸态氮含量的影响

由图2中A可知,在制曲阶段,曲料的氨基酸态氮含量在18 h内上升很快,从0.06%升至0.23%,18 h之后趋于平稳。

图2 豆豉发酵过程中氨基酸态氮含量的变化Fig.2 Change of amino acid nitrogen content during the fermentation of fermented soybeans

由图2中B可知,在后发酵阶段,随着发酵时间的增加,豆豉中的氨基酸态氮含量逐渐增加,而且盐度越低,豆豉的氨基酸态氮含量越高。盐度为7%、9.5%、12%的豆豉在后发酵20 d时的氨基酸态氮含量分别为0.92%、0.88%、0.61%。

2.3 不同盐度对豆豉发酵过程中总酸含量的影响

由图3可知,在制曲阶段,曲料的总酸含量起伏较大,在18 h时升至最高后下降,30 h后又略有上升,至制曲42 h为1.13%。拌入食盐等配料进入后发酵阶段后,7%盐度豆豉的总酸含量呈平稳上升趋势;9.5%和12%盐度豆豉的总酸含量先下降后逐渐上升。在后发酵阶段结束时,豆豉的盐度越低,总酸含量越高;盐度为7%、9.5%、12%的豆豉总酸含量分别为1.84%、1.79%、1.28%,均控制在2%的标准内。

图3 豆豉发酵过程中总酸含量的变化Fig.3 Change of content of total acids during the fermentation of fermented soybeans

2.4 不同盐度对豆豉成品氨基酸含量的影响

经测定,不同盐度的豆豉产品中各种氨基酸含量见表1。

表1 不同盐度豆豉中的氨基酸含量Table 1 Content of amino acids in fermented soybeans with different salinities %

由表1可知,豆豉的盐度越低,氨基酸总含量越高。盐度为7%、9.5%、12%的豆豉氨基酸总含量分别为30.30%、28.21%、26.38%;鲜味氨基酸含量分别为15.48%、15.18%、14.25%,与12%盐度的豆豉相比,7%、9.5%盐度的豆豉分别提升了8.63%和6.53%。其中,谷氨酸含量分别增加了6.12%和3.96%;天门冬氨酸含量分别增加了8.88%和7.16%。

3 结论

本文研究了7%、9.5%、12%的盐度对豆豉发酵理化性质的影响,结果表明,盐度越低,豆豉成品的蛋白酶酶活、氨基酸态氮、总酸和氨基酸总含量越高。后发酵20 d后,盐度为7%、9.5%、12%的豆豉的氨基酸态氮含量分别为0.92%、0.88%和0.61%,总酸含量分别为1.84%、1.79%和1.28%,氨基酸总含量分别为30.30%、28.21%和26.38%。从营养健康和产品质量方面考虑,豆豉发酵适宜的盐度为7%～9.5%。本研究为豆豉的生产开发与质量控制提供了技术指导和参考依据。