魏家保 唐双燕* 赵伟志 郑晓英 张 辉 谭 沛

1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518000；2.华润三九现代中药制药有限公司，广东 惠州 516000

南五味子为木兰科植物华中五味子S.sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果实。秋季果实成熟时采摘，晒干，除去果梗和杂质[1]。目前，中国药典及相关文献[2-6]以五味子酯甲作为南五味子的质量控制指标，南五味子化学成分复杂，含有较多的木脂素类成分，因此用单一指标成分的质量控制容易以偏概全，无法全方位、多范围地准确控制饮片的质量[7-10]。文献[11-13]记载的华中五味子分布区有：江苏、安徽、河南、山西、陕西、甘肃、湖北、四川、江西、湖南、贵州、云南和福建等省份，且市场商品南五味子主要来源于野生，野生南五味子资源分布较为广泛[14-15]。不同产地的生态环境差异较大。因此本研究通过收集不同产地南五味子，建立南五味子特征图谱方法，并同时对南五味子中五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素的含量进行多指标测定，对不同产地的药材质量进行综合质量评价。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪：Agilent 1290 Infinity II，包括G7104A型四元泵、132位自动进样器、G7116B型柱温箱、二极管阵列检测器；METTLER TOLEDO ME36S百万分之一分析天平、METTLER TOLEDO XS204十万分之一分析天平；SK5200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 试剂 试药五味子酯甲(批号：111529-201706；纯度：95.2%)；五味子甲素(批号：110764-201915；纯度：99.5%)；5-羟甲基糠醛(批号：111626-202114；纯度：98.7%)；原儿茶酸(批号：110809-201906；纯度：97.7%)，均购于中国食品药品检定研究院。五味子酯乙(批号：DST201218-011；纯度：98%)、五味子酯丙(批号：DST211112-066；纯度：98%)，均购于成都德思特生物技术有限公司。五味子酯丁(批号：21110102；纯度：98%)购于成都埃法生物科技有限公司；安五脂素(批号：STD7390120；纯度：98%)购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙腈为色谱纯，水为超纯水；磷酸、甲醇等其它试剂均为分析纯。

1.3 样品研究 用15批南五味子分别来源于陕西安康、四川绵阳、陕西西安、河南南阳以及山西运城，收集的药材经安徽中医药大学刘守金教授鉴定均为木兰科华中五味子S.sphenantheraRehd.et Wils.的干燥成熟果实。详细信息见表1。

表1 15批南五味子信息表

2 方法

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：ACQUITY BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7 μm)，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱(0～6 min，5%A；6～7 min，5%→45%A；7～25 min，45%→50%A；25～35 min，50%→70%A；35～40 min，70%→90%A)；检测波长：280 nm(12 min前)，220 nm(12 min后)；柱温为35 ℃；流速为0.3 mL/min；进样量2 μL；理论板数按五味子酯甲峰计算应不低于6000。

2.2 特征图谱参照物溶液的制备 取南五味子对照药材约2.0 g，置具塞锥形瓶中，加水50 mL，加热回流30 min，滤过，取滤液蒸干，加入甲醇25 mL超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过，取续滤液，即得对照饮片参照物溶液。取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸对照品适量，加50%甲醇制成每1 mL各含50 μg的溶液，另取含量测定对照品溶液作为对照品参照物溶液。

2.3 含量测定对照品溶液的制备 取五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL各含0.10 mg的溶液，作为含量测定对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25 mL，称定重量，加热回流30 min，取出，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 专属性 按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，并考察空白溶剂是否会造成干扰。按上所述色谱条件进行UPLC分析，记录色谱图，如图1所示。结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。

A.专属性;B.混合对照;C.南五味子药材图谱

3.1.2 精密度考察 取同一份南五味子供试品溶液，连续进样6次，记录共有峰的保留时间和峰面积，结果表明了各共有峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于2.0%；并计算含量结果RSD%，五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量RSD%分别1.9%、0.8%、0.8%，结果表明仪器精密度良好。

3.1.3 重复性考察 取同一批南五味子6份，按供试品溶液的制备方法制备，记录共有峰的保留时间和峰面积，结果表明了各共有峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于2.0%，并计算含量结果RSD%，五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量RSD%分别0.9%、0.5%、0.7%，本方法重复性良好。

3.1.4 溶液稳定性考察 取南五味子供试品溶液，配制后在第0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样，记录共有峰的保留时间和峰面积，结果表明了各共有峰与参照峰的相对保留时间、相对峰面积RSD值均小于2.0%，并计算含量结果RSD%，五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量RSD%分别1.0%、1.1%、0.9%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定，可以满足测定的需要。

3.1.5 线性关系考察 精密吸取浓度储备液依次配制浓度为0.42 mg/mL、0.21 mg/mL、0.08 mg/mL、0.13 mg/mL、0.004 mg/mL五味子酯甲溶液、浓度为0.99 mg/mL、0.55 mg/mL、0.22 mg/mL、0.05 mg/mL、012 mg/mL安五脂素溶液、浓度为0.98 mg/mL、0.58 mg/mL、0.21 mg/mL、0.05 mg/mL、0.01 mg/mL五味子甲素溶液。精密吸取2 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为，五味子酯甲：y=17079697.464x-143949.426，R2=0.999，安五脂素：y=9863991.036x-397671.591，R2=0.999，五味子甲素：y=12808394.387x+35291.424，R2= 1.000。五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素的进样量分别在0.0085～1.5388 μg、0.0246～3.1944 μg、0.0216～2.7705 μg范围内线性关系良好。

3.1.6 准确度考察 精密称取9份南五味子各约 1.0 g，分别精密加入五味子酯甲对照品溶液(甲醇溶解；0.0494 mg/mL、0.0988 mg/mL、0.1482 mg/mL)、安五脂素对照品溶液(甲醇溶解；0.1156 mg/mL、0.2312 mg/mL、0.3468 mg/mL)及五味子甲素对照品溶液(甲醇溶解；0.0734 mg/mL、0.1468 mg/mL、0.2202 mg/mL)25 mL，按供试品制备方法处理，进行含量测定。结果五味子酯甲平均回收率为99.42%，RSD值为3.4%，安五脂素平均回收率为99.36%，RSD值为3.2%，五味子甲素平均回收率为98.37%，RSD值为1.7%，表明方法准确性良好。

3.2 含量测定 取15批南五味子，按上述方法检测，结果见表2。由结果可知，不同产区南五味子药材有效成分五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素含量存在一定差异，各产区药材五味子酯甲和五味子甲素含量陕西周至县与山西平陆县较高，陕西省旬阳县、四川平武县及河南西峡县含量较低，安五脂素含量在陕西周至县、山西平陆县及河南西峡县较低，陕西省旬阳县、四川平武县含量较高，不同产地南五味子指标成分含量分布情况如图2所示。其中，相同产区不同批次间药材含量也有所不同，同产区不同批次药材含量也存在一定波动，采用Graphpad Prism对不同产地之间的五味子酯甲含量、安五脂素、五味子甲素含量进行统计分析，结果见表3，分析结果显示五味子酯甲含量在陕西省西安市周至县、山西省运城市平陆县产区含量较高，相较其他产区具有显著差异；安五脂素含量在陕西省安康市旬阳县，四川省绵阳市平武县产区含量较高，相较陕西西安周至县具备显著差异；五味子甲素含量在不同产区、相同产地不同批次间存在一定波动，各产区之间无显著差异。

图2 不同产地南五味子指标成分含量分布图

表2 不同批次南五味子含量测定结果表

表3 不同产地南五味子含量统计分析表

3.3 特征图谱共有模式建立 取15批南五味子，按“2.4”项方法制备供试品溶液，再按“2.1”项色谱条件进行测定，将实验数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，将各色谱峰匹配，建立特征图谱呈现10个共有特征峰，如图3所示，10个峰占比色谱峰总面积的95%以上，提示该方法可用于南五味子药材质量的整体评价，其中1号、2号、5号、8号、9号峰的保留时间应分别与5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素对照品参照物峰的保留时间相对应，与五味子酯甲参照物相应的峰为S峰，计算特征峰3、峰4、峰6、峰7、峰10与S峰的相对保留时间，分别为：0.85(峰3)、0.97(峰4)、1.02(峰6)、1.05(峰7)、1.52(峰10)。

(A)南五味子饮片对照图谱

3.4 聚类分析 以15批次样品中五味子酯甲、安五脂素、五味子甲素的含量为变量，采用SPSS 20.0进行聚类分析，采用组间连接法，以欧氏距离作为样品的测度，如图4所示，当距离为7时，结果15批药材样品可聚为3大类，1～3聚为一类，产地为陕西安康，4～6，11、13聚为一类，分布在陕西、山西一带，7～10，12、14、15聚为一类，分布在河南陕西一带，聚集类别与产地存在一定关联，结论与含量统计学结果基本一致。

图4 聚类分析树状图

结合所建立的特征图谱共有模式，以15批次样品中五味子酯甲参照物相应的峰为S峰，计算各共有特征峰的相对峰面积，并以此为变量，采用SPSS 20.0进行聚类分析，采用组间连接法，以欧氏距离作为样品的测度，如图5所示。当距离为3时，结果15批药材样品可聚为3类，1～3聚为一类，产地为陕西安康；4～6，11～13聚为一类，分布在陕西、山西一带；7、9、10、14、15聚为一类，分布在河南陕西一带，特征聚类结果与含量聚类结果一致。

图5 聚类分析树状图

3.5 主成分分析 利用SPSS 20.0软件，将15批南五味子特征图谱中10个共有峰的相对峰面积进行标准化处理，再通过主成分法进行因子分析。总方差解释结果显示，共有2个主成分的特征值大于1，方差贡献率分别为55.175%、18.974%，累计方差贡献率为55.175%、74.149%，表明其可代表南五味子特征图谱共有峰的大部分信息。结果见表4。

表4 南五味子前2个主成分的特征值和方差贡献率表

利用SPSS 20.0软件，同时绘制碎石图，如图6所示。由图可知，前2个主成分之间的坡度较陡，其余主成分之间的坡度逐渐趋于平缓，表明这10个主成分中，前2个主成分具有主导作用。

图6 南五味子特征图谱中10个共有峰的主成分碎石图

利用SPSS 20.0软件，以共有峰的相对峰面积为变量，同时进行成分矩阵分析，详见表5。由表5可知，第1主成分主要反映峰3～4，6～7，9对应成分的信息，其中峰4为五味子酯丙、峰6为五味子酯乙、峰7为五味子酯丁、峰9为五味子甲素，峰3未知；同时对第一主成分，和第二主成分为变量，投影得到二维投影图，如图7所示。通过投影图对特征进行描述，绝对值越大，说明其对于主成分的影响越大，这种影响是可以通过所对应的点到原点的距离进行衡量的，由以上图表可知通过因子分析降维处理后所提取的2个主成分能代表南五味子特征图谱中10个共有峰的主要信息。

图7 南五味子主成分二维投影图

表5 南五味子主成分矩阵表

综上，通过单一含量指标结果分析：五味子酯甲和五味子甲素含量陕西周至县与山西平陆县较高，相较其他产区具有显著差异(P<0.05)；安五脂素含量在陕西省安康市旬阳县，四川省绵阳市平武县产区含量较高，相较陕西西安周至县具有显著差异(P<0.05)；五味子甲素含量在不同产区、相同产地不同批次间存在一定波动，各产区之间无显著差异。但综合3个成分及特征图谱结果进行聚类分析及主成分分析，结果显示，不同产地及相同产地不同批次间含量及特征图谱存在一定差异，样品质量与产地有一定关联性。因此，所建立UPLC特征图谱及多指标含量测定方法简便、易行，结合聚类分析和主成分分析可用于南五味子的质量控制。

4 讨论

《中国药典》中五味子酯甲为南五味子药材的含量指标成分，文献中虽然对多种木质素类成分进行了(五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素等)定量分析。但结合南五味子特征图谱研究发现，五味子酯甲和五味甲素在特征图谱中呈现且有较高的响应，安五脂素为南五味子与五味子区分成分，故参考药典及相关文献报道建立了UPLC特征图谱方法同时测定五味子甲素、安五脂素和五味子酯甲3个指标含量。

色谱条件考察时考虑南五味子中所含的有机酸类和木质素类分别在280 nm和220 nm处有最大吸收，因此检测波长选择了切换波长的方式。同时对不同品牌的色谱柱进行筛选，最终采用ACQUITY BEH C18色谱柱，通过对不同有机相体系(甲醇、乙腈)、不同缓冲盐(0.1%磷酸、0.1%醋酸、0.1%甲酸)、不同柱温(32 ℃、35 ℃、38 ℃)、不同流速(0.25 mL/min、0.30 mL/min、0.35 mL/min)、不同品牌仪器(waters H-class和Agilent 1290Ⅱ)的考察，确定以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相；柱温为35 ℃；流速为0.30 mL/min，实现了对有机酸成分与木脂素成分的合并洗脱。此外，还考察了不同提取溶剂(水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇提取效果，结果甲醇提取效果最好)，不同提取方式(超声和回流，结果回流提取效果较好)，所建立UPLC特征图谱10个共有峰主要定量峰达到基线分离，兼具定性和定量作用，为南五味子药材的质量控制及评价提供参考。