高嘉雯 朱旭江，* 姚世霞 牛钰婷

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070

甘草多糖胶囊系经水提醇沉法提取甘草中的多糖，加辅料制成的胶囊剂，为甘肃省中医院的院内制剂，临床用于提高免疫力[1-2]。该制剂的质量标准中采用3，5-二硝基水杨酸比色法(DNS)，单点外标法测定甘草多糖的含量，试验时发现操作过程复杂，试剂配制耗时，且辅料存在干扰，导致结果重现性较差。常用的多糖测定方法有：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法等[3-5]。其中，苯酚-硫酸法操作简便，测定快速，较为常用[6-7]。许多研究[8-10]发现，苯酚-硫酸法在测定结果的准确度和稳定性上均优于蒽酮-硫酸法。有研究[11-12]发现，在同质量浓度下，对比葡萄糖对照品溶液吸光度，苯酚-硫酸法的吸光度大于蒽酮-硫酸法和DNS法，表明苯酚硫酸法的测定结果更灵敏。因此，通过研究，建立了苯酚-硫酸比色法测定甘草多糖胶囊的含量，并通过正交实验设计优化显色条件，方法简便准确，可用于该制剂的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Lambda365紫外可见分光光度计(PerkinElmer公司)；MS205DU十万分之一天平(瑞士梅特勒公司)；ME204电子天平(瑞士梅特勒公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；漩涡混合器(IKA VORTEX2)。

1.2 试药 甘草多糖胶囊(批号分别为:200402、200403、200301，甘肃省中医院提供)；D-无水葡萄糖(批号：110833-201707，含量99.9%，中国食品药品检定研究院)蒽酮、苯酚、3，5-二硝基水杨酸、酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取D-无水葡萄糖对照品103.49 mg，置100 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取储备液5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取甘草多糖胶囊内容物适量，混匀，研细，精密称取0.1 g，置250 mL量瓶中，加水200 mL，旋涡振荡器混合5 min，超声(功率500 W，频率40 kHz)处理30 min，放冷至室温，加水至刻度，摇匀，取适量，过滤，精密量取滤液5 mL，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2 最大吸收波长的测定 精密吸取0.4 mL“2.1.1”项下对照品溶液，置刻度试管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，振荡摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，立即摇匀，冷却至室温。以相应试剂为空白，在400～700 nm扫描光谱。由图1结果可知对照品溶液在490 nm处有最大吸收，故选择490 nm为测定波长。

图1 对照品溶液的可见光谱图

2.3 正交实验设计优化显色条件 通过前期实验发现，苯酚和硫酸的加入量、反应时间均对结果有较大影响，因此，采用L9(34)正交试验设计，以吸收度为考察指标优选最佳显色条件，并运用SPSS 27.0统计软件对试验结果进行方差分析。正交试验因素与水平见表1，正交试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计与结果表

表3 方差分析结果表

由表2直观分析可知，各因素对综合评分影响的顺序为B>A>C；由表3的方差分析可知，浓硫酸用量对显色具有显著意义。综合直观分析和方差分析结果，确定总多糖含量测定条件的最佳工艺条件为A2B1C3，即苯酚用量为1 mL，硫酸用量为5 mL，放置时间为30 min。经对同一批样品制备3批供试品溶液进行验证，结果RSD为3.0%(n=3)，显色条件方法可行。

2.4 标准曲线的绘制 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，分别置具塞刻度试管中，加水至1 mL，摇匀，加入5 %苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入硫酸5 mL，摇匀，放置30 min，加水至10 mL，冰浴冷却，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(2020版中国药典通则0101)，在490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为方程为：y=0.0048x+0.0252，r=0.9995，表明葡萄糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1内线性关系良好。

2.5 专属性考察 按处方比例及制备工艺，制成不含甘草多糖的阴性样品，按“2.1.2”制成供试品溶液，测定吸收度。结果吸收度小于0.001，表明辅料不干扰实验，有较好的专属性。

2.6 精密度试验 精密吸取“2.1.1”项下葡萄糖对照品溶液0.4 mL，按“2.4”项下方法，重复测定吸光度6次，结果6次吸光度的RSD=0.06%(n=6)，表明精密度较好。

2.7 重复性试验 取甘草多糖胶囊(批号：200402)粉末约0.1 g，精密称定，平行6份，按“2.1.2”制成供试品溶液，按照“2.4”项下方法测定其吸光度A，用标准曲线计算供试品溶液中葡萄糖的含量(mg/g)。结果平均含量为345.98 mg/g，RSD=1.88 %(n=6)。

2.8 稳定性试验 取同一批号样品(批号：200402)，精密称取0.1 g，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.4”项下方法测定其吸光度，每间隔 5 min测定1次，共测定6次。结果平均吸光光度为0.3864，RSD值为1.93 %(n=6)。表明样品甘草多糖测定在30 min内基本稳定。

2.9 加样回收试验 取已知含量的甘草多糖胶囊(批号：200402)9份，每份0.05 g，精密称定，分别精密加入其样品多糖含量的50 %、100 %、150 %的对照品溶液，每个比例加3份，按“2.1.2”制成供试品溶液。分别精密移取 1 mL，按照测定标准曲线的方法测定其吸光度，测定平均加样回收率为99.5%，RSD = 3.0%(n=9)，表明回收率良好。结果见表4。

表4 加样回收试验结果表

2.10 样品的含量 测定取3批甘草多糖胶囊各0.1 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下方法测定吸光度，计算其中多糖含量。结果见表5。

表5 样品的含量测定结果表

3 讨论

苯酚-硫酸法是利用多糖在浓硫酸作用脱水生成糠醛衍生物，糠醛与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定[13]。本试验在单因素试验基础上，建立正交试验设计，考察了苯酚、浓硫酸用量和反应时间3个因素对甘草多糖含量测定的影响。最终确显色条件为即加入苯酚1 mL，硫酸5 mL，放置时间为30 min。该方法操作简便，试剂易得，能快速准确测定甘草多糖的含量。

此外，分别选用超声法、回流法、水浴保温法以及直接溶解法等4种方式作为样品中多糖的提取方法制备供试品溶液，在490 nm处测定吸光度值，结果显示，超声法测定结果较高，且操作简便，故选用其作为样品的制备方法。

通过方法学考察，验证了本方法精密度高，重复性好，稳定性和准确度均较好。采用苯酚-硫酸法测定甘草多糖胶囊中多糖的含量，方法可行，操作简单，可用于甘草多糖胶囊的质量控制，对指导临床用药及制订制剂质量标准有一定参考价值。