夏 铂 范 灵

宁夏医科大学，宁夏 银川 750004

脊髓损伤作为一种严重创伤性事件，在交通、劳动及运动事故中较为常见，导致中枢神经系统致残损伤。常造成损伤部位以下运动、感觉等功能不可逆转丧失，同时引起肌肉萎缩、压疮、感染，严重导致呼吸障碍[1-2]。脊髓损伤临床手段很多，如手术疗法、大剂量激素冲击疗法、理疗康复等[3]。但损伤后中枢神经细胞完全恢复很难，这些治疗方法只能减少继发性脊髓损伤发生，防止脊髓功能进一步恶化，恢复不了已损伤神经恢复功能。因此，研发一些行之有效治疗促进脊髓损伤处神经细胞修复再生，以恢复脊髓结构及功能是临床急需解决问题。烙灸是脊髓损伤一种新疗法，临床已经取得一定疗效。前期观察烙灸对脊髓损伤大鼠Wnt信号通路作用。发现烙灸能激活Wnt信号通路[4]，而Wnt信号通路能促进多种来源干细胞发生神经分化[5]。此外，Wnt信号通路是调控内源性神经干细胞主要通路[6]。本人提出烙灸激活脊髓损伤大鼠Wnt信号通路，促进其内源性神经干细胞增殖分化为神经元细胞，同时抑制分化为星形胶质细胞，使其神经细胞修复再生。为验证假说，故设计本实验，揭示其机理，为临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠50只，SPF级，体质量240～290 g，来自宁夏医科大学实验动物中心。大鼠在安静环境下饲养，给予充足饲养和饮用水，室温20～22 ℃，相对湿度45%，保持动物房内昼夜节律。动物实验严格遵循3R原则。实验方案经宁夏医科大学伦理研究原著委员会批准。

1.1.2 试剂 与仪器巢蛋白抗体(Nestin，DF7754，Affinity)，神经胶质纤维酸性蛋白抗体(Glial Fibrillary Acidic Protein，#80788，Cell Signaling Technology)，封闭液(浓缩型正常山羊血清，中杉金桥)，光学显微镜 (LEICA，德国)、Image-lab图像分析系统和Image-Pro 图像分析系统(BIORADHERCULES，美国)。石蜡切片机(RM2235，Leica公司，德国)，全波长酶标仪(Epoch，Biotek公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 脊髓损伤模型 大鼠制备除假手术组外，其他4组大鼠均采用水合氯醛腹腔麻醉，俯卧位固定于大鼠固定器上，椎板咬骨钳咬去T9～T11棘突和椎板，充分露出脊髓组织，避免损伤硬脊膜。运用改良自制Allen’s大鼠脊髓损伤打击装置，使打击棒套入钢管内，通过砝码测量打击棒打击重量达10 g，打击高度5 cm，打击棒自由下落，致使T9～T11节段急性脊髓损伤(不完全性瘫大鼠脊髓损伤模型，属中等程度损伤)。大鼠有摆尾反射，双下肢瘫痪证实造模成功。假手术组只做椎板切除，不损伤脊髓。术后大鼠分笼，饲养于配有空调专用室，注意术后护理防止感染，每日按压膀胱区排尿3次，保持垫料干燥。观察记录大鼠双后肢活动情况、立足伸趾能力、回缩反射、大小便等状态。模型的建立参照《药理实验方法学》[7]及相关文献的方法造模。

1.2.2 实验分组及造模干预 随机将50只SD大鼠分为5组，假手术组：只做椎板切除，不做脊髓损伤。模型组：只造模。Wnt抑制剂组：造模成功后12 h给予Wnt抑制剂腹腔注射给药，每日1次，持续28 d。烙灸组：造模成功后12 h后采用烙灸治疗，烙灸组造模后每日同一时间重复治疗一次，持续28 d。烙灸联合Wnt抑制剂组：造模成功后12 h给予Wnt抑制剂腹腔注射给药，同Wnt抑制剂组，并采用烙灸治疗，同烙灸组，持续28 d。烙灸干预：在损伤大鼠两侧夹脊穴(在距损伤上下端两个椎体棘突间隙旁开距中线3～4 mm处夹脊穴)上，用特制烙灸器，W形薄铁皮制作灸槽，带有手柄，依据损伤脊柱长度制作，放于损伤脊柱上，在灸槽内放入艾绒点燃，艾绒加热传导铁器，铁器传导患处，使局部发热，严格观察皮肤情况，造模后每日1次，每次5 min。

1.2.3 标本采集与处理 干预28 d，将大鼠采用全身灌注多聚甲醛取材，以损伤脊髓为中心取纵向离损伤点长约1 cm脊髓，制成石蜡包块用于免疫组化、免疫荧光检测损伤组织内源性神经干细胞标记物-神经丝巢蛋白(Nestin)、神经元细胞标记物-神经元特异性稀醇化酶(neuron specific enolase，NSE)和星形胶质细胞标记物-胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。

1.2.4 脊髓损伤运动功能(basso beattie bresnahan，BBB)评分[8]两名不知道实验分组观察者，于造模后第3天、7天、14天、28天运用BBB运动评定量表评估各组大鼠后肢运动情况，评估指标主要包括各个关节活动情况、跨步能力以及其协调性与躯干平衡能力等，0分(无运动功能)至21分(正常运动功能)，两人背向评估，平均值是大鼠运动功能最终得分。

1.2.5 免疫组化检测 将石蜡切片脱蜡入水，经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，利用柠檬酸进行微波修复抗原、内源性过氧化物酶阻断、血清封闭后滴加Nesti(1∶250)，GFAP(1∶400)，β-Catenin(1∶400)和GSK-3β(1∶400)，4 ℃过夜；第2天，PBS漂洗后加入二抗孵育40 min，PBS漂洗后DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，冲洗返蓝，脱水、透明、中性树胶封固，显微镜下观察并拍片。

1.2.6 免疫荧光检测 切片常规脱蜡至水，将切片置于EDTA抗原修复液，微波炉中高火加热至沸腾，室温冷却5 min后，再中高火加热3 min，再自然冷却至室温。滴加山羊血清封闭液(原液用PBS按1∶9稀释)，37 ℃孵育30 min。甩去多余液体，不洗。实验片滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜。取出后37 ℃复温30 min，PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min，3次。滴加DyLight488荧光素标记羊抗兔IgG，37 ℃ 孵育45 min。PBS(pH 7.2～7.6)洗5 min，3次。滴加DAPI染色液，室温孵育3 min。PBS(pH 7.2～7.6)清洗。抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察结果及拍照。采用ImageJ软件分析各个单位视野内大鼠脊髓组织Nestin、NSE、GFAP阳性细胞数。

2 结果

2.1 BBB运动功能评分结果 假手术组大鼠运动功能正常。第3天评分：模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠运动功能评分均小于7分，差异无统计学意义(P>0.05)。第7、14天评分：烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组评分高于模型组、Wnt抑制剂组，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。第21天评分：烙灸组>烙灸联合wnt抑制剂组>模型组>Wnt抑制剂组。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组较烙灸组评分降低，差异有统计学意义(P<0.05)；第28天评分：烙灸组最高，Wnt抑制剂组最低，差异有统计学意义(P<0.05)，Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，如图1。

注：与模型组比较，aP<0.05；与wnt抑制剂组比较，bP<0.05；与烙灸组比较，cP<0.05。

表1 各组大鼠损伤后不同时间点BBB评分表

2.2 免疫组化检测结果 累积光密度值统计假手术组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值为0。其余4组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值都较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组与模型组、Wnt抑制剂组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中NSE累积光密度值较假手术组显著减少，尤其是模型组、Wnt抑制剂组减少幅度最大，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸组相比降幅明显，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中GFAP累积光密度值较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组较模型组、Wnt抑制剂组减少，差异有统计学意义(P<0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组较烙灸组高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，如图2。

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与Wnt抑制剂组比较，cP<0.05；与烙灸组比较，dP<0.05。

表2 各组脊髓损伤大鼠Nestin、NSE、GFAP累积光密度比较表

2.3 免疫荧光检测结果 免疫荧光检测Nestin、NSE、GFAP阳性细胞数 Nestin、NSE、GFAP阳性细胞呈绿色，形态树枝状。Nestin假手术组无阳性细胞。NSE、GFAP假手术组阳性细胞数较多，亮度较亮。其余4组大鼠脊髓组织中Nestin阳性细胞数较假手术组显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组与模型组、Wnt抑制剂组相比明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸组相比明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中NSE阳性细胞数较假手术组显著减少，模型组、Wnt抑制剂组减少幅度最大，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸组相比降幅明显，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中GFAP阳性细胞数较假手术组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组较模型组、Wnt抑制剂组数值减少，差异有统计学意义(P<0.05)。烙灸联合Wnt抑制剂组较烙灸组高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，如图3。

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与Wnt抑制剂组比较，cP<0.05；与烙灸组比较，dP<0.05。

表3 各组脊髓损伤大鼠免疫荧光检测Nestin、NSE、GFAP阳性细胞数表

3 讨论

3.1 关于烙灸治疗脊髓损伤研究 脊髓损伤是导致截瘫主要原因，全世界平均每年每百万人中有15～40人发生脊髓损伤。给伤者、家庭及社会带来沉重负担，但至今未找到确切、有效治疗方法[9]。研究证实脊髓损伤后神经细胞仍存在一定修复再生能力，而成年哺乳动物脊髓损伤后神经很难修复再生。中医学认为脊髓损伤是督脉损伤，致使气血逆乱，阻滞经络，气血不能温煦濡养肢体导致气血不足，筋脉瘀阻。治宜补气、活血、通络。烙灸是宁夏少数民族医学中一种简单、方便、安全、有效的疗法，也是中医学“化脓灸”发展及延续，其操作比“化脓灸”简便，其透热力强，造成皮肤损伤程度小。而脊髓损伤病机是元阳不足，气滞血瘀，寒凝闭阻经络致使肢体屈伸不利。需要通过强力热效应刺激周围神经敏感度，加强其与大脑中枢神经联系。烙灸具有强力热效应，正有此功效。其能够振奋元阳、温通经脉、化瘀消肿、寒湿祛湿、通经活络而调整人体气机禀性[10]。研究[11]表明，烙灸能够打开药物或热力至皮肤内组织通道，起到消炎、镇痛、增加血液循环、增强机体代谢作用。前期临床观察也证实烙灸治疗脊髓损伤患者能明显提高肌力，促进脊髓损伤患者康复[12]。

3.2 各组大鼠实验结果 分析前期实验研究[4]发现，烙灸可以调节Wnt信号通路，对大鼠脊髓损伤后神经具有修复再生作用。本实验采用BBB运动神经功能评分法、免疫组化、免疫荧光法检测脊髓损伤大鼠脊髓组织内源性神经干细胞标记物(Nestin)、神经元细胞标记物(NSE)、星形胶质细胞标记物(GFAP)。其中BBB评分法是一种定量、客观检测技术，能够对脊髓损伤作出功能性诊断及定量分析。结果显示：BBB运动神经功能评分，烙灸组>烙灸联合Wnt抑制剂组>模型组>Wnt抑制剂组，推断烙灸组、烙灸联合wnt抑制剂组效果明显优于模型组、Wnt抑制剂组，且烙灸组疗效最显著，Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。神经丝巢蛋白(Nestin)是一种细胞骨架蛋白，表达于细胞质中，生存于神经上皮干细胞内，与神经干细胞发育及分化息息相关。其发育期时，Nestin表达逐渐增强，而随着神经干细胞分化结束，Nestin表达也随之下降，Nestin被认为是内源性神经干细胞主要标记物之一，检测Nestin能够鉴定处于分化期内源性神经干细胞[13]。正常脊髓组织内也存在一定量内源性神经干细胞，在非病理情况下，成年动物(神经细胞分化结束)体内内源性神经干细胞处于“静止状态”。研究表明在大鼠出生后6 d脊髓组织中Nestin阳性表达消失。本实验结果证实，假手术组大鼠脊髓组织中Nestin亦累积光密度值及阳性细胞数为0，表明假手术不会引起内源性神经干细胞激活。而大鼠脊髓损伤后Nestin累积光密度值及阳性细胞数显著升高，它主要集中在损伤部位，可见脊髓损伤能够激活内源性神经干细胞，导致内源性神经干细胞向损伤部位迁移。烙灸组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值及阳性细胞数升高趋势与模型组相似，但是烙灸组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值及阳性细胞数都较模型组有显著升高，可见烙灸能够促进脊髓损伤后损伤局部内源性神经干细胞激活、迁移与增殖。而Wnt抑制剂组与模型组相比，虽无统计学意义，但Wnt抑制剂组值低于模型组，说明Wnt通路被抑制情况下，内源性神经干细胞激活程度明显减低。反过来说明激活Wnt通路，有助于内源性神经干细胞激活。烙灸联合Wnt抑制剂组升高值低于烙灸组，也证实这一点。NSE(神经元特异性稀醇化酶)是神经元细胞特异性标志物，脊髓损伤后大量神经元细胞调亡，如何补充替代缺失神经元细胞是治疗关键。在脊髓组织自我修复过程中，无外界干预情况下，仅少数内源性神经干细胞会分化为神经元细胞[14]。本实验结果也证明，损伤引起脊髓组织中NSE累积光密度值及阳性细胞数下降，模型组大鼠脊髓组织NSE累积光密度值及阳性细胞数急速减少，而其经过烙灸治疗后，损伤局部NSE累积光密度值及阳性细胞数较模型组显著升高，表明烙灸组对损伤局部神经元细胞具有促进其修复及增生功效。而Wnt抑制剂组值低于模型组，说明Wnt通路被抑制情况下，神经元细胞修复及增生能力降低。反过来说明激活Wnt通路，可促进神经元细胞修复及增生。烙灸联合Wnt抑制剂组值低于烙灸组，也证实这一点。GFAP(胶质纤维酸性蛋白)是星形胶质细胞骨架蛋白，和星形胶质细胞运动及形状调节密切相关，其是星形胶质细胞特异性标记物。发育期时，星形胶质细胞可诱导神经元突起定向生长。成年动物体内星形胶质细胞又具有支持、营养、隔离及保护神经元细胞作用。然而，当中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞反应性增生，其过度增生会形成胶质瘢痕，同时分泌抑制性分子，影响神经细胞修复再生[15]。结果显示，脊髓损伤后局部GFAP累积光密度值及阳性细胞数就显著增多。而烙灸组GFAP累积光密度值及阳性细胞数损伤后也有增加，但其表达都较模型组显著减少。据此可知，烙灸可能抑制脊髓损伤后损伤局部星形胶质细胞过度增生，减少瘢痕组织的形成，从而促进轴突再生。而且相关研究[16]已证实，降低GFAP累积光密度值及阳性细胞数能减少胶质瘢痕形成，使轴突得以生长及修复，降低对神经细胞损害，从而促进脊髓损伤大鼠肢体运动功能恢复。而Wnt抑制剂组值高于模型组，说明Wnt通路被抑制情况下，减少胶质瘢痕形成能力减弱。反过来说明激活Wnt通路，可减少胶质瘢痕形成。烙灸联合Wnt抑制剂组值高于烙灸组，也证实这一点。

综上所述，烙灸有利于脊髓损伤大鼠神经功能恢复，通过激活脊髓损伤大鼠Wnt信号通路，促进其内源性神经干细胞增殖分化为神经元细胞，同时抑制分化为星形胶质细胞，使其神经细胞修复再生。