张向卉 郭晓晓 田洪成 梅娟娟 翟清亮 王雁林

滨州医学院附属医院生殖医学科 山东 滨州 256003

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是引起排卵障碍性不孕症的常见的生殖内分泌疾病,对于调整生活方式、促排卵或手术治疗后失败,以及合并其他不孕因素的患者可尝试辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)助孕。多中心随机对照研究证实,PCOS患者冻融周期移植(frozen embryo transfer,FET)与新鲜周期移植比较有更高的活产率,而且流产及卵巢过度刺激综合征发生率更低[1]。本研究旨在筛选PCOS患者首次FET后活产率的影响因素,并构建可视化的诺莫预测模型。

1 资料与方法

1.1 研究对象 于滨州医学院附属医院生殖中心2018年5月—2020年3月行ART的PCOS患者,纳入标准:①根据2018年《多囊卵巢综合征中国诊疗指南》诊断标准确诊的PCOS患者;②全胚冷冻后首次冻融移植周期;③年龄20～45岁。排除标准:子宫畸形、粘膜下肌瘤及宫腔粘连;夫妇双方中有染色体异常;子宫内膜异位症;复发性流产及分析的指标不完整者。该研究经伦理委员会同意,所有患者已签署知情同意书。

1.2 ART过程

1.2.1 冷冻胚胎准备 新鲜周期取卵后行常规体外受精或卵胞浆内单精子注射及胚胎培养,对于可移植胚胎于取卵后第3、5或6天行全胚冷冻,胚胎冷冻方法为玻璃化冷冻,胚胎移植前均行辅助孵化。

1.2.2 胚胎质量评价 以复苏后胚胎质量为准,卵裂期优质胚胎定义为细胞数7～9个,细胞大小符合发育阶段,碎片程度<10%,无多核。优质囊胚则为3期及3期以上且内细胞团及滋养层评分不含C的囊胚。

1.2.3 子宫内膜准备 本研究中包括人工周期、促排卵周期和自然周期,常规阴超监测卵泡发育,子宫内膜厚度、血流及形态。人工周期为内膜≥8 mm且雌激素应用超过14 d后加用孕激素。

1.2.4 黄体支持 自然周期及促排卵周期肌注黄体酮40～60 mg/d或黄体酮软胶囊400～600 mg/d或黄体酮凝胶 90 mg/d,超声可见胎心后逐渐减量,至孕10周停药;人工周期移植后肌注黄体酮 40 mg/d或黄体酮软胶囊600 mg/d或黄体酮凝胶 90 mg/d,移植后28～35 d孕激素逐渐减量,用药至10～12 w。

1.2.5 妊娠及活产确定 超声检查观察到一个或多个孕囊诊断为临床妊娠,包括正常宫内妊娠、异位妊娠、宫内外同时妊娠,可以仅见孕囊未见胎心。妊娠不足28 w、胎儿体质量不足1 000 g而终止妊娠,称为流产。活产是指每移植周期中取得至少1例活产的分娩数。

1.3 其他指标的确定 身体质量指数(body mass index,BMI)为体质量/身高2(kg/m2),根据《中国成人超重和肥胖症预防与控制指南》分类,BMI<24 kg/m2为体重正常组,≥24 kg/m2为超重及肥胖组。血脂异常的诊断标准参照《中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)》,即血清胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白四项指标中,任意一项异常便为血脂异常组。

1.4 统计学方法

1.4.1 统计软件 数据分析通过SPSS 21.0及R软件 4.0.5完成,定量资料以均数±标准差表示,数据比较采用t检验。定性资料以例数(百分比)表示,数据比较采用卡方检验。诺莫模型的构建及验证通过R软件程序包“VIM”“rms”“pROC”及“Formula”。

1.4.2 模型构建 诺莫模型通过2018年5月—2019年8月的129例PCOS患者构建,首要观察指标为FET后的活产率,单因素分析筛选影响活产率的影响因素(P<0.1),进入二元logistic多因素回归分析,确定独立的影响因素并计算回归系数,然后通过R软件绘制诺莫预测图。

1.4.3 模型评价 预测模型的评价包括内部验证和外部验证,验证内容为区分度及校准度,区分度(discrimination)是指模型区分结局事件发生率高和低不同人群的能力,而校准度(calibration)是评价模型预测个体发生结局事件概率准确性的指标,反映的是模型预测风险与实际发生风险的一致程度。模型构建的训练集验证为内部验证,而外部验证则为模型的实战,利用不同医疗中心或不同时段的数据证明模型的延展性及准确度。本研究选用2019年9月—2020年3月61例患者为非同期外部验证人群,利用ROC曲线下面积(area under the curve ,AUC)评价预测模型的区分度。通过模型校准图判断校准度。

2 结果

2.1 一般资料 本研究中训练集及验证集人群平均年龄均在30岁以内,超重及肥胖占比、不孕年限、不孕类型、不孕因素及血脂异常占比无统计学差异,移植的胚胎类型和内膜厚度亦无差别,但验证集中平均移植胚胎个数显著小于训练集且有统计学意义。训练集及验证集患者一般情况见表1。

表1 患者一般情况

2.2 单因素及多因素筛选 以是否活产作为因变量,年龄、BMI、FSH、胚胎数目、胚胎类型、是否有优质胚胎、内膜厚度、AMH、不孕年限及是否血脂异常作为自变量进行单因素及多因素回归分析,变量赋值见表2。通过多因素筛选,PCOS首次FET后的活产率与是否有优质胚胎、移植胚胎数目、体重指数及血脂是否异常密切相关。血脂异常、超重及肥胖、单胚胎移植以及无优质胚胎者移植术后活产率明显下降。单因素及多因素筛选的结果见表3。

表2 因变量及自变量赋值表

表3 单因素及多因素二元logistic回归分析

2.3 模型构建 基于上述单因素及多因素分析结果,构建预测PCOS患者首次FET后活产率的诺莫模型,通过数据分析患者年龄对活产率的影响无统计学意义,但基于临床经验及既往研究纳入模型。图1即为构建的诺莫预测模型,比如28岁PCOS患者,胚胎类型为优质囊胚,得分100分, BMI 23.45 kg/m2得分38分,血脂异常不得分,囊胚移植2枚得分41分,年龄对应分值为36分,共计总分为215分,则活产率为76%。

图1 诺莫预测模型

2.4 模型验证 图2为评价区分度的ROC曲线AUC,训练集和验证集的AUC均>0.7,提示模型有良好的区分度。图3为校准图,图中对角线为标准线,代表模型预测值与实际值吻合,内部验证和外部验证的预测值及校正值(bias-corrected)都靠近标准线,表示预测数和实际观测数差别不大,模型校准度满意。

图2 内部验证及外部验证的ROC曲线

图3 内部验证及外部验证的校准图

3 讨论

诺莫模型最早用于恶性肿瘤患者的预后估计,筛选各个影响因素之后通过回归系数计算权重及得分,不同的汇总分值对应相应的生存率,并为患者及医生提供简单可视的图形[2-3]。Gao等[4]通过178名PCOS患者构建诺莫模型,预测首次移植(新鲜周期或冻融周期)后的活产率,发现血清胆固醇水平,BMI及基础FSH是活产的独立影响因素。鉴于新鲜周期与冻融周期患者体内激素水平及生理特征的差异,本研究以全胚冷冻后首次冻融周期移植的患者为研究对象,最终构建以年龄、是否有优质胚胎、BMI、移植胚胎数目及是否血脂异常为基础的诺莫预测模型,具有良好的区分度和校准度,对首次冻融周期移植的PCOS患者做出妊娠率及活产率的评估,指导临床医师做出移植决策及后续诊疗方案。

本研究中PCOS患者高脂血症的发生率为51.76%。血脂水平异常的患者不但不孕症发生率高,妊娠早期及晚期并发症的发病风险也明显增加[5]。高松城等[6]发现,血甘油三酯及胆固醇水平与受精率、卵裂率和优胚率呈负相关关系,认为监测血脂水平可用于评估胚胎质量。对于合并血脂异常的PCOS患者,初次超促排卵后的累积妊娠率明显下降[7],而助孕前降脂药物应用则可明显提高胚胎移植后的临床妊娠率和持续妊娠率[8]。动物实验提示高脂水平通过改变基因表达、促进细胞凋亡等机制影响卵母细胞的发育潜能及胚胎的质量[9]。血脂水平异常可通过改变卵母细胞及胚胎质量影响胚胎植入,引起不孕症及妊娠丢失的发生。

BMI对ART妊娠结局的影响尚有争议。本研究表明,BMI与PCOS患者首次冻融周期移植后的活产率呈负相关关系。PCOS患者超重及肥胖的发生率明显高于其他人群,既往有多项研究发现随着BMI的升高,PCOS患者的妊娠率或活产率随之下降[4,10]。体重增加与血脂障碍、胰岛素抵抗、高尿酸、血糖升高及糖尿病等代谢性疾病互为因果,体重增加相关的代谢异常会改变卵泡液的营养构成,超重患者卵泡液中脂蛋白及总蛋白的水平高于体重正常者,而敏感的卵母细胞会受到微环境中代谢异常的影响,进而降低胚胎的发育潜能及妊娠结局[11-12]。体重增加还会对子宫内膜产生影响。Bellver等[13]在种植窗期间行子宫内膜活检提示,肥胖患者的基因表达与正常体重者存在差异,合并PCOS的肥胖患者异常表达基因与生长发育、营养代谢、免疫调节及生长因子调控等方面相关。除此之外,部分基因与胚胎种植及不孕原因不孕症相关[14-15]。对9 000多个供卵周期的研究发现,移植前胚胎数据无差异基础下,随着体重的增加,妊娠率及活产率均呈下降趋势,提示超重及肥胖患者可能通过降低子宫内膜的容受性而影响妊娠结局[16]。

年龄对ART成功率的影响众所周知,随着年龄增加,临床妊娠率及活产率均明显降低[17]。美国大数据调查提示,小于35岁患者ART后活产率为40.1%,超过42岁患者则仅为4.5%[18]。本研究中年龄与活产率无明确相关性,考虑原因如下,一为人群问题,本研究患者的平均年龄29.72岁,高龄患者占比较少,而年龄主要通过影响卵巢储备功能而降低妊娠率,本研究中人群为PCOS患者,卵巢功能良好。除此之外,样本量偏小也是其中的原因。

随着移植胚胎数目的增加,活产率相应增加,但多胎妊娠问题随之而来,因此国内指南推荐在基本不影响胚胎着床率和妊娠率的基础上,减少胚胎移植数目,持续关注减少多胎妊娠。本研究建议关于胚胎移植数目,应该让患者充分知情同意,对于诺莫预测活产率较高的患者,可积极推行单胚胎移植,但对于评分不高或胚胎质量较差者,在告知多胎妊娠母婴风险基础上可移植2枚胚胎。

样本量和回顾性性质使本文有一定局限性,但对于首次FET的PCOS患者,本研究构建的诺莫模型可以个体化、量化及可视化地预测活产率,便于医患沟通及临床决策的实施,同时强调了BMI和血脂异常对妊娠结局的影响,为助孕前的体重干预及纠正代谢异常提供理论依据。