姜建喜 孙洪亮 刘春娇 王雁林 李清春

滨州医学院附属医院生殖医学科 山东 滨州 256603

近年来兴起的时差成像系统(time-lapse imaging, TLI)能对胚胎发育情况进行全程监控,可提供大量的胚胎发育信息,为胚胎筛选提供了新的可能。这项技术的优点是可以记录胚胎动态发育的全过程,无需反复打开培养箱,为胚胎发育提供更加稳定的培养环境[1]。本研究创新性地将同周期同患者的受精卵随机置于时差成像系统和桌面培养箱中进行卵裂期胚胎培养,并对集合培养形成的囊胚首次复苏周期移植临床结局进行了对比分析,探讨时差成像系统培养和筛选胚胎的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2020年7月至2022年1月间,选取在本中心接受体外受精(in vitro fertilization,IVF)或卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)治疗的患者,共113个周期,将同一周期同一患者获得的受精卵随机分成两组进行卵裂期胚胎培养,实验A组(113周期) 为受精卵置于时差成像系统中,对照B组(113周期)为受精卵置于桌面培养箱中;进一步对上述两组无新鲜周期移植、并第一次行复苏周期单囊胚移植(第五天优质囊胚)的患者分组比较,实验C组(42周期)来源于实验A组的患者,对照D组(33周期)来源于对照B组的患者。排除因素:成熟卵子数(MII卵数)<5 个;行补救卵胞浆内单精子注射(rescue-intracytoplasmic sperm injection,R-ICSI)。

1.2 实验方法

1.2.1 胚胎培养 本中心全部患者采用常规促排卵方案,注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)36 h后行卵泡穿刺术,将获得的卵冠丘复合物(oocyte coroma cumulus complex,OCCC)置于G-IVF培养液中等待受精。注射hCG后39～40 h进行常规受精或ICSI,精卵共孵育4～5 h后脱颗粒。ICSI后的卵子随机转移至含G-1的35 mm培养皿液滴中和含G-1的Culture Coin专用培养皿中;而常规受精后的卵子继续置于含G-IVF的四孔皿中过夜,受精后约18 h评估原核,再将受精卵随机转移至两种培养皿中。G-1培养皿置于桌面培养箱(COOK公司)培养,含G-1的Culture Coin专用培养皿置于时差成像系统(ESCO公司)中培养,培养环境均为37℃、6%CO2、5%O2。

1.2.1.1 时差成像系统培养 本研究使用ESCO Miri TL时差成像系统,图像采集频率为10 min/次,每小时进行一次7个等焦距平面扫描。培养采用14孔Culture Coin专用培养皿,每孔均有标记。第3天对胚胎进行常规形态学评分,待胚胎移植或冷冻后,将剩余胚胎移出,移入含G-2的35 mm培养皿液滴中进行集合培养,置于桌面培养箱中继续培养至第5～6天,对囊胚进行常规形态学评级。

1.2.1.2 桌面培养箱培养 第3天对胚胎处理方式及囊胚培养方式同时差成像系统。

1.2.2 胚胎评分标准 受精后第3天(D3)对卵裂期胚胎进行形态学评分,根据分裂速度和碎片比例分为4个等级,分别为:Ⅰ级,胚胎发育速度正常,卵裂球大小、数目均等,胞质均匀、无空泡,碎片不超过5%;Ⅱ级,胚胎发育速度正常,卵裂球大小、数目均等或大致均等,胞质均匀、无空泡,碎片6%～20%;Ⅲ级,胚胎发育速度大致正常,卵裂球大小、数目均匀或不均匀,胞质有少量空泡,碎片21%～50%;Ⅳ级,胚胎发育速度异常,卵裂球大小、数目不均等,胞质不均匀、有大量空泡,碎片大于50%。以上Ⅰ、Ⅱ级胚胎统称为优质胚胎,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎统称为可利用胚胎。

1.2.3 囊胚评级 受精后第5～6天对囊胚进行评级,根据囊胚腔的大小和是否孵化将囊胚的发育分为6期,其中3期及以上囊胚根据内细胞团和滋养层细胞数目进行分级,分为A、B、C 3级,将3期及3期以上评分为AA、AB、BA、BB的囊胚定义为优质囊胚,将3期及3期以上评分为AA、AB、BA、BB、BC的囊胚定义为可利用囊胚。内细胞团及滋养层细胞不同时含C的囊胚均冷冻保存。

1.2.4 囊胚冷冻、复苏和移植 所有可用囊胚使用商品化的冷冻和复苏液,按照试剂盒说明书进行囊胚的冷冻和复苏。分析纳入研究的113周期患者冷冻囊胚复苏情况,选择第一次行复苏周期第五天(D5)单优质囊胚移植的患者进行分组,最终实验C组纳入42周期,对照D组纳入33周期。所有复苏周期均采用人工周期方案准备内膜。复苏后囊胚转入G-2培养液培养2 h后等待移植。入组要求:第一次复苏胚胎移植、移植1枚第5天囊胚、囊胚评级≥4 BB;截止到2022年1月25日。

1.3 观察指标 主要的观察指标为2PN卵裂率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率、临床妊娠率、种植率和流产率。2PN卵裂率=2PN卵裂数/2PN数×100%;D3优质胚胎率=D3优质胚胎数/正常受精卵裂胚胎数×100%;囊胚形成率=3期及3期以上囊胚数/行囊胚培养的卵裂期胚胎总数×100%;可利用囊胚形成率=可利用囊胚数/行囊胚培养的卵裂期胚胎总数×100%;优质囊胚形成率=优质囊胚数/行囊胚培养的卵裂期胚胎总数×100%;临床妊娠率=妊娠周期数/移植周期数×100%;流产率=早期自然流产患者数/临床妊娠患者数×100% 。临床妊娠是以移植后5 w通过超声检查探及宫内孕囊为标准。早期自然流产是指临床妊娠12 w之前的妊娠丢失。

2 结果

2.1 新鲜周期实验室指标的比较 同一患者同一周期受精卵随机分组培养,根据不同受精方式和年龄进行分层比较,结果显示,A组和B组在2PN卵裂率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率方面比较,差异均无统计学意义,见表1、2、3。因为 ICSI方案、年龄>35岁的仅有2周期,所以两组间未进行统计学分析。

表1 IVF方案、年龄≤35岁,A组和B组患者实验室指标的比较/%

表2 IVF方案、年龄>35岁,A组和B组患者实验室指标的比较 /%

表3 ICSI方案、年龄≤35岁,A组和B组患者实验室指标的比较/%

2.2 复苏周期妊娠结局的比较 对纳入研究的75个复苏周期患者进行随访,实验C组与对照D组患者年龄、转化日内膜厚度及流产率比较,差异均无统计学意义。但实验C组临床妊娠率和着床率显著高于对照D组,P<0.05,见表4。

表4 C组和D组患者一般情况及妊娠结局的比较/%

3 讨论

生理状态下,胚胎在体内处于恒温、恒湿、低氧、避光的环境,为了模拟体内胚胎的培养环境,良好稳定的培养箱对体外胚胎培养至关重要。目前大多数中心仍然采用传统的培养箱,可为配子和胚胎发育提供理想的温度、湿度和气体浓度[2]。然而,由于需要频繁打开培养箱评估胚胎发育情况,使得胚胎长期暴露于培养箱外,会改变胚胎培养环境的温度、湿度及气体浓度。时差成像培养系统的引入,使胚胎观察和评分无需再将胚胎从培养箱中取出,从而在胚胎发育期间保持稳定的培养环境[3]。

多数研究认为,与传统培养箱相比,时差成像系统的应用有利于胚胎发育和改善妊娠结局[4-8],但其他研究[9-12]认为两者之间并无显著差异。目前多数研究为回顾性分析,旨在比较传统培养箱和时差成像系统两组间培养效果的差异。本研究将同一患者同一周期的受精卵随机置于两种培养箱中进行培养,有效地控制了患者的基本情况,消除了两组间基线资料的差异,对两组间培养效果进行了前瞻性的分析。另外,本研究根据不同受精方式和不同年龄进行分层分析,发现两组间2PN卵裂率、D3优质胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚形成率、优质囊胚形成率方面均无统计学差异。王世凯等[13]研究认为,TL组(time-lapse 培养组)的优质胚胎率显著高于CO组(常规培养组)(45.21% vs 41.92%),差异有统计学意义,但两组间在2PN卵裂率、囊胚形成率、优质囊胚率方面比较差异无统计学意义。高洋等[14]研究认为TLI系统和传统培养系统间的2PN卵裂率、囊胚形成率、可利用囊胚率和优质囊胚率比较无显著性差异。这两个研究均未按照受精方式和年龄的不同进行详细的分层分析,可能造成研究结果的偏倚。纪冰等[15]将TLI培养的473个IVF周期和同期行常规培养的347个IVF周期作为研究对象,每组中按年龄分为<37岁组和≥37岁组,比较两组间卵裂率和优质囊胚率等均无差异,与本研究的研究思路相似,研究结论一致。

由于纳入研究的113个周期患者新鲜胚胎移植病例数较少,也为了减少新鲜胚胎周期卵巢刺激、血激素水平[16]及内膜因素[17]的干扰,本研究对这些患者的复苏周期胚胎移植情况进行了随访,并且将研究对象限定为:第一次复苏周期移植、单个优质D5囊胚。充分考虑到了冻胚移植次数、移植胚胎数目、移植胚胎天数、移植胚胎形态等混杂因素对结果的影响,降低了研究偏倚。本研究发现,实验C组临床妊娠率和种植率显著高于对照D组(83.33% vs 60.61%),而流产率间差异无统计学意义。这与高洋等[14]的研究结论较为一致。

本研究创新之处在于将同一患者同一周期的胚胎随机分组培养,前瞻性的研究并按照受精方式和年龄分层分析两组间培养效果的差异。另外,复苏囊胚移植周期中,限定了移植次数、移植胚胎数目、移植胚胎天数、移植胚胎形态等因素,尽量减少混杂因素的干扰,使两组间妊娠结局比较更具有可信性。

本研究也存在不足之处,首先,为了比较两种不同培养体系在同一胚胎评分标准下,培养效果及妊娠结局方面的差异,本研究时差成像系统胚胎评分仍采用形态学评分的方法,未同时结合胚胎发育动力学参数筛选胚胎,未能发挥出该系统在胚胎发育动力学、卵裂模式分析等方面的优势。其次,本研究中时差成像系统仅进行了卵裂期胚胎培养,囊胚培养全部在桌面培养箱中进行,并按照同一来源胚胎同一液滴集合培养,这也可能会对结果分析产生影响。再次,本研究纳入的样本数较少,下一步在积累足够数量病例的前提下,逐步构建本实验室的胚胎评价体系和移植胚胎模型,便于快速有效的选择胚胎。

综上所述,时差成像系统确实能提供较为稳定的培养环境,并能对胚胎进行动态评估,提高胚胎的优选和鉴别能力,可能改善患者的妊娠结局。