张 芳，陆瑞华，傅焕哲，张文华，李 重，任 钢，陈占平，赵玉玲，郭 盛，钱大玮，段金廒*

基于AFLP分子标记的我国不同生态栽培产区枸杞资源遗传多样性分析

张 芳1，陆瑞华1，傅焕哲1，张文华2，李 重2，任 钢3，陈占平3，赵玉玲4，郭 盛1，钱大玮1，段金廒1*

1. 南京中医药大学药学院，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023 2. 宁夏百瑞源枸杞股份有限公司，宁夏 银川 750200 3. 青海省海西蒙古族藏族自治州农业科学研究所，青海 德令哈 817000 4. 新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州精河县枸杞产业发展中心，新疆 博尔塔拉 833399

利用荧光标记辅助的扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术，从基因组DNA水平上分析我国6个栽培生产区域52份枸杞样本的遗传多样性。对提取的枸杞DNA样本进行酶切、连接、预扩增和选扩增等步骤，扩增产物经毛细管电泳系统分离和数据采集后，利用Popgene软件计算遗传多样性参数，利用GenAlex软件计算遗传距离并进行主坐标分析，利用MEGA-X软件根据遗传距离进行聚类分析，利用Structure软件进行群体遗传结构分析。共筛选得到10对AFLP选择性扩增引物组合，扩增得到328条扩增片段，其中多态性片段121条，且在不同产地枸杞居群间多态性位点分布不均匀。分析显示不同栽培产区枸杞的遗传多样性较低，等位基因数（observed number of alleles，a）、有效等位基因数（effective number of alleles，e）、观测杂合度（Nei’s gene diversity，）和香浓信息指数（Shannon information index，）分别为1.438 0、1.231 6、0.140 7和0.215 2，Nei’s遗传相似性范围为0.835 4～0.890 2。不同栽培生产区域的枸杞居群间存在较为频繁的基因交流，遗传分化程度中等。居群内部遗传变异是枸杞遗传变异的主要来源，居群间遗传变异不显著，同时遗传距离与地理距离没有明显相关性。可为枸杞的遗传背景信息积累、引种栽培、种质资源保护、核心种质库构建以及可持续开发策略的制定和管理提供科学依据。

枸杞属；扩增片段长度多态性；种质资源；遗传多样性；栽培生产区域

遗传多样性是指种内不同群体或同一群体不同个体之间通过长期进化积累的遗传变异的总和，是该物种在自然压力下适应外部复杂环境变化、维持生存和进化潜力的物质基础，也是评价物种生物多样性、生物资源状况的重要指标[1]。在适应生存环境变化的过程中，一个物种（或群体）的遗传多样性越丰富，表明环境适应能力、生存能力和进化潜力越强，越容易开拓新的生长环境并扩展自然分布范围。相反，低水平的遗传多样性往往伴随遗传杂合度降低和近交衰退，并进一步制约物种或种群的环境变化适应能力和进化潜能，增加种群灭绝的风险[2]。

DNA分子标记技术已成为分析遗传多样性时必不可少的手段，主要包括基于Southen杂交的限制性内切酶片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记技术，基于PCR的随机扩增多态性（random amplified polymorphism，RAPD）标记技术、简单重复序列（simple sequence repeats，SSR）标记技术和简单重复序列间区（inter-simple sequence repeat，ISSR）标记技术、相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）标记技术[3-4]，以及基于PCR与限制性酶切技术结合的分子标记，如扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）标记技术和酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS）标记技术[5]。这些标记技术各有优势，其中AFLP技术是基于限制性酶切和PCR扩增的全基因组DNA扩增片段长度多态性检测方法[6]。AFLP技术扩增结果稳定，标记多态性条带比例高，获得信息量大，不受物种基因组来源、复杂程度和环境条件的影响，尤其适用于遗传背景模糊、材料来源广泛的物种遗传资源的标记分析，是进行种质资源遗传多样性和遗传结构研究的最为有效的分子标记技术之一，目前已在多种动植物资源的遗传图谱构建、种质资源鉴定和评价、遗传多样性分析、遗传变异规律分析及品种家系分析等领域得到广泛应用。近年来，AFLP技术逐渐引入中药资源研究领域，并在薏苡[7]、忍冬[8]、乌头[9]、厚朴[10]、三叶木通[11]等中药材的遗传多样性分析中发挥了重要作用。

枸杞是茄科（Solanaceae）枸杞属L.多年生多分枝落叶灌木，是我国重要的药食两用植物资源，其果实枸杞子早在《神农本草经》已被列为上品。枸杞属植物约有80余种，我国有7个种和2个变种[12]，自然分布于我国西北干旱地区温带荒漠区域和温带草原区域。枸杞对恶劣环境适应能力强，具有较强的抗旱耐寒耐盐碱特性。近年来，我国枸杞的引种栽培产业十分活跃，核心产区由宁夏回族自治区逐步向外辐射至我国新疆、青海、甘肃、内蒙等省区，多数品种（系）在不同区域均有种植。在长期的自然演化、资源交流、地理隔离、遗传漂变和人工选育等多种因素共同作用下，枸杞的基因型高度杂合，遗传背景复杂，表型变异丰富，同物异名或同名异物现象普遍。

目前有关我国枸杞资源地理分布范围内遗传多样性水平和遗传结构变异领域的研究较为缺少。尹跃等[13]建立和优化了枸杞的SRAP反应体系，唐燕等[14]对宁夏中宁县26份枸杞属种质资源的27个表型性状进行分析后发现，供试种质的遗传多样性较为丰富，李彦龙等[15]采用AFLP技术对宁夏银川地区的15份枸杞进行分析，发现不同品种的枸杞样本之间遗传多样性较为丰富，任重等[16]采用SSR分子标记，发现红果枸杞栽培品种之间遗传差异较小，鲍红春等[17]利用ISSR技术对10个枸杞品种的遗传差异进行研究，发现宁夏地区和内蒙古地区的枸杞品系存在较大差异，但种群内部遗传相似性较高。余意等[18]采用SSR技术分析我国4个省区17个栽培宁夏枸杞居群的178个个体样本后，发现栽培已经引起枸杞遗传多样性明显下降。

本研究收集了我国6个主要生产栽培产区的52份枸杞样本，借助荧光标记辅助的毛细管电泳检测技术，建立基于枸杞全基因组遗传多样性特征的AFLP分析技术体系，从基因组DNA分子水平上分析枸杞主要生态产区不同栽培品系的遗传多样性和遗传结构差异，以充分了解和掌握其遗传多样性和遗传特征信息及亲缘关系，为枸杞的遗传背景信息积累、引种栽培、种质资源保护、种质创新、核心种质库构建以及可持续开发策略的制定和管理提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ABI3730xl毛细管电泳系统（美国Applied Biosystems公司）；PowerPac HC高电流电泳仪及Mini-Sub Cell DT电泳系统（美国BIO-RAD公司）；C1000 Touch PCR仪（美国BIO-RAD公司）；ChemiDoc XRS+化学发光凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）；Nano Drop 2000c型微量核酸检测仪（美国Thermo Scientific公司），MicroCL 21R微量离心机（美国Thermo Scientific公司）。

1.2 材料

供试样本52个（表1），由本课题组于2019年7月至2019年8月采集自我国枸杞的主要栽培产区宁夏银川平原（15株，海拔1126 m，38°40′ N，106°03′ E）、新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州精河县（11株，海拔320 m，44°36′ N，82°54′ E）、甘肃省酒泉市玉门市（7个，海拔1517 m，40°18′ N，97°24′ E）、甘肃省白银市靖远县（4株，海拔1406 m，36°36′ N，104°44′ E）、青海省海西州德令哈市（4株，海拔2996 m，37°23′ N，97°22′ E）、内蒙古自治区巴彦淖尔市（11株，海拔1034 m，40°58′ N，107°00′ E）。采集时选取生长旺盛的成年单株盛果期植株，采集从上至下第5对健康、无病虫的展开叶片，用蒸馏水冲洗表面并用滤纸干燥后迅速放入带有标签的自封袋中，干冰保存运输。所有样品由南京中医药大学段金廒教授鉴定为茄科枸杞属植物枸杞.的叶。

表1 供试样品信息

Table 1 Sample information

序号样品名称采集地序号样品名称采集地 1宁农杞2号宁夏银川27短日照宁杞1号甘肃玉门 2宁农杞9号宁夏银川28未知种甘肃玉门 3宁杞2号宁夏银川29宁杞5号甘肃玉门 4菜用枸杞宁夏银川30玉门未知种甘肃玉门 5中科绿川1号宁夏银川31宁杞5号甘肃玉门 6珍珠枸杞宁夏银川32宁杞1号甘肃玉门 7宁杞5号宁夏银川33宁杞1号甘肃玉门 8蒙杞1号宁夏银川34蒙杞1号甘肃靖远 9中华枸杞宁夏银川35靖远宁杞7号甘肃靖远 10宁杞7号宁夏银川36宁杞5号甘肃靖远 11中科黄果1号宁夏银川37宁杞1号甘肃靖远 12黄果枸杞宁夏银川38宁杞5号青海德令哈 13黑枸杞宁夏银川39宁杞1号5年青海德令哈 14宁杞1号宁夏银川40宁杞7号青海德令哈 15宁杞1号宁夏银川41宁杞1号青海德令哈 16蒙杞1号新疆精河42科杞608内蒙古巴彦淖尔 17宁杞1号新疆精河43中科绿川1号内蒙古巴彦淖尔 18精河枸杞4号新疆精河44宁杞7号内蒙古巴彦淖尔 19精河枸杞5号新疆精河45宁杞2号内蒙古巴彦淖尔 20宁农杞4号新疆精河46宁杞9号内蒙古巴彦淖尔 21宁杞3号新疆精河47宁杞10号内蒙古巴彦淖尔 22宁杞7号新疆精河48蒙杞1号内蒙古巴彦淖尔 23宁杞5号新疆精河49当地品种内蒙古巴彦淖尔 24宁农杞5号新疆精河50宁杞5号内蒙古巴彦淖尔 25宁农杞1号新疆精河51宁杞4号内蒙古巴彦淖尔 26宁杞1号新疆精河52宁杞1号内蒙古巴彦淖尔

1.3 试剂

限制性内切酶I和I购自New England BioLabs公司；DNA连接酶DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞和DNA聚合酶TMHot Start Version，DNA Marker DL5 000和DL15 000均购自TaKaRa公司；扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；羟基荧光素（5’-FAM）修饰引物由北京睿博兴科生物科技有限公司合成；其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 样品DNA提取

取各地样品约100 mg，采用改良的CTAB法进行基因组总DNA的提取，具体方法参考本课题组前期报道[19]，取1 μL DNA用Nano Drop 2000c微量核酸蛋白检测仪检测DNA的质量和浓度，260/280比值应在1.7～1.9；另取琼脂糖电泳另取5 μL DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察，检测DNA的完整性和纯度。

2.2 AFLP体系建立与分析

2.2.1 酶切和连接体系

（1）酶切：DNA样品分别用I与I进行酶切：酶切反应体系25 μL，包括DNA 300 ng，I和I各15 IU，酶切缓冲液CutSmart 2.5 μL，补ddH2O至25 μL，37 ℃水浴酶切10 h，65 ℃灭活20 min。

（2）连接反应：根据接头引物表（表2），将I单链接头和I单链接头分别稀释后变性并退火形成双链接头。连接反应体系25 μL，包括5 μL酶切产物，7.5 μmol/L双链接头，1U DNA连接酶，16 ℃连接过夜。

（3）预扩增反应：预扩增反应体系25 μL，包括2 μL稀释后连接产物，1 UHS DNA聚合酶，1 μL dNTP （2.5 mmol/L），5 μmol/LE00和M00预扩增引物（表2）。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸15 min。

（4）选择性扩增反应：选择性扩增反应体系25 μL，包括1.5 μL稀释后预扩增产物，1 U DNA聚合酶，2 μL dNTP （2.5 mmol/L），5 μmol/LI选择性扩增引物，1.5 μmol/LI选择性扩增引物。PCR反应条件分为3个阶段：第1阶段为13个循环，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，65 ℃退火（每个循环退火温度递减1 ℃），72 ℃延伸1 min；第2阶段为23个普通PCR循环，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；最后阶段72 ℃延伸10 min。选择性扩增完成后，根据琼脂糖电泳结果筛选特异性条带清晰且数量适宜的引物对。

2.2.2 毛细管电泳检测 根据选择性扩增引物筛选结果，运用荧光标记技术在筛选出的引物对中对I引物序列末端进行5’-FAM荧光标记，并根据已建立的酶切、连接及PCR扩增反应体系完成所有样本的选择性扩增，PCR产物用ABI 3730xl毛细管电泳系统进行分离，采用激光诱导荧光采集数据。电泳结果在Gene marker 2.2.0软件中进行可视化处理，获得多态性DNA片段电泳图谱及扫描峰图。

2.3 遗传多样性数据分析

2.3.1 电泳结果矩阵转换 使用Gene marker 2.2.0 软件电泳峰值图进行扫描和判读，选取大小在50～500 bp的片段进行统计，同一迁移位置有表征片段位点记为“1”，无表征片段位点记为“0”，进行结果“0/1”赋值并构建多态性位点“0/1”矩阵。

表2 接头和引物序列信息

Table 2 Sequence information of adaptors and primers

接头与引物EcoR I (5’-3’)Mse I (5’-3’) 接头ICTCGTAGACTGCGTACCGACGATGAGTCCTGAG 接头IIAATTGGTACGCAGTCTACTACTCAGGACTCAT 预扩引物GACTGCGTACCAATTC（E00）GATGAGTCCTGAGTAAC（M00）

2.3.2 遗传多样性数据计算 利用Popgene 32软件计算多态性位点数（number of polymorphic loic，）、多态性位点百分比（percentage of polymorphic loic，）、观测等位基因数（observed number of alleles，a）、有效等位基因数（effective number of alleles，e）、Nei’s基因多样性指数（Nei’s gene diversity，）、香农多样性信息指数（Shannon information index，）、总基因多态性（t）、群体内基因多态性（s）、遗传分化指数（st）、基因流（estimate of gene flow fromst，m），以及各居群间遗传距离（genetic distance）和遗传相似性，分析居群内和居群间的遗传变异分布。利用Arlequin V3.5.2.2软件进行分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）计算遗传变异在各产地居群间及居群内所占百分比。

2.3.3 主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）、遗传距离与地理距离相关性分析 利用GenAlex 6.502软件计算个体间遗传距离并进行PCoA，根据降维处理的信息评估遗传多样性的分化。采用MEGA-X软件根据遗传距离进行个体间的非加权组成配对法（unweighted pair group method analysis，UPGMA）聚类分析并构建聚类图。根据GenAlex 6.502软件根据各栽培产区的经纬度计算各产区之间的地理距离，并进行所有枸杞样本地理距离与遗传距离的相关性分析。

2.3.4 群体遗传结构分析 利用Structure V2.3.4进行基于贝叶斯算法的样本来源判断，以反映群体的遗传结构。设定群组数（）为2～10，每个重复10次模拟运算，MCMC重抽样设为10 000，分析结果导入在线工具Structure Harvester （http://taylor0. biology. ucla.edu/structureHarvester/）计算预测最优居群数，然后利用Distruct 1.1软件生成枸杞遗传结构条形堆积图。

3 结果与分析

3.1 枸杞AFLP体系建立

用＋I组合后对枸杞基因组DNA进行酶切，图1-a和图1-b分别是酶切后和预扩增后的代表性电泳图谱，可见经双酶切后原基因组DNA主条带消失，在原主带下方出现均匀弥散带，经酶切产物进行预扩增后，PCR产物在500 bp以下区域形成连续的均匀弥散带，在高相对分子质量区无扩增产物，表明DNA消化彻底，预扩增结果合理，符合AFLP选择性扩增的要求。

图1-c为代表性选择性扩增图谱，共设计了10个I选扩引物和9个I选扩引物，组合后得到90对选扩引物组合，根据选扩图谱，从中筛选出10对选扩谱带清晰、数量适宜、多样性位点丰富的10对选扩引物对，10对选扩引物及其序列见表3。

3.2 选扩条带的多态性分析及遗传多样性分析

图2为代表性DNA扩增片段电泳图谱及扫描峰图，对特征性条带进行“0/1”赋值并转换为数据矩阵用于遗传多样性分析。

图1 枸杞基因组DNA酶切(a)、预扩增(b) 及选择性扩增(c) 后琼脂糖电泳图谱

表3 选择性扩增引物组合

Table 3 Selective amplification primers

编号EcoRI (5’-3’)MseI (5’-3’) p1GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACAC p2GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACAA p3GACTGCGTACCAATTCACCGATGAGTCCTGAGTAACTA p4GACTGCGTACCAATTCACGGATGAGTCCTGAGTAACCA p5GACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGTAACTT p6GACTGCGTACCAATTCAGGGATGAGTCCTGAGTAACCA p7GACTGCGTACCAATTCAGCGATGAGTCCTGAGTAACTT p8GACTGCGTACCAATTCAGCGATGAGTCCTGAGTAACCA p9GACTGCGTACCAATTCAGAGATGAGTCCTGAGTAACTA p10GACTGCGTACCAATTCAACGATGAGTCCTGAGTAACCA

图2 枸杞DNA的AFLP分析选择性扩增代表性电泳图谱(a) 及扫描峰图(b)

筛选后的10对选扩引物组合对6个不同产区52个枸杞DNA参试样本进行扩增，结果见表4。结果表明，在50～500 bp共扩增出328条选择性扩增片段，其中多态性片段121条，在不同产地枸杞居群多态性位点分布不均匀，各居群枸杞多态性位点百分比为25.30%～71.65%，平均为60.32%，说明本研究筛选出的选扩引物和建立的AFLP标记方法在参试枸杞样本中检测到较为丰富的多态性，适于分析其遗传多样性和遗传结构分析。

不同居群枸杞的a变化范围为1.253 0～1.716 5，平均为1.438 0，e变化范围为1.276 2～1.481 8，平均为1.231 6。各居群内部a略高于e，表明各居群中等位基因的分布较为均匀，遗传差异较小，但存在有效种群规模变小和有效等位基因丢失的情况。同时，不同居群间的a和e的变化范围较小，说明我国不同生态产区的枸杞居群间存在着一定的遗传差异性，但差异程度较低。变化范围为0.105 9～0.166 6，平均为0.140 7。范围为0.153 9～0.273 8，平均为0.215 2，呈现出一定的遗传异质性但是水平较低、遗传同质性较高的多样性特点，说明我国枸杞种质的遗传基础较为狭窄，遗传多样性不显著。其中宁夏银川居群内部多样性相对较高，群内遗传分化处于相对较高水平，与宁夏地区作为我国主要的枸杞引种起源中心的实际情况相一致。

表4 不同栽培生产区域枸杞居群间的遗传多样性指数

Table 4 Genetic diversity of different populations of L. chinense

产地APP/%NaNeHI 宁夏银川（n＝15）23571.651.716 5±0.451 41.248 8±0.276 60.166 6±0.150 80.273 8±0.217 6 新疆精河（n＝11）14544.211.442 1±0.497 41.224 7±0.317 00.138 3±0.177 40.213 1±0.260 1 甘肃玉门（n＝7）12638.411.384 1±0.487 11.220 8±0.330 00.132 7±0.181 60.200 9±0.266 1 甘肃靖远（n＝4） 8325.301.253 0±0.435 41.187 2±0.336 10.105 9±0.184 80.153 9±0.266 6 青海德令哈（n＝4）10933.231.332 3±0.471 81.231 1±0.342 50.134 5±0.193 40.197 2±0.281 9 内蒙古巴彦淖尔（n＝11）16450.001.500 0±0.500 81.277 0±0.348 10.166 1±0.189 50.252 4±0.274 3 群体间12136.891.368 9±0.483 21.240 1±0.350 20.140 1±0.192 40.207 8±0.279 5

3.3 群体变异的AMOVA分析

由表5所示的枸杞居群AMOVA分析结果表明，不同居群的枸杞居群间存在一定程度的遗传分化。在总的遗传变异中，不同栽培生产区域的各居群间的变异仅有6.09%，居群内的变异率为93.91%，居群内部的遗传变异率远大于不同产地间居群间的变异率，说明居群内部变异是枸杞居群变异的主要来源，这与前述遗传多样性的分析结果相一致。

表5 不同栽培生产区域枸杞居群的分子方差分析（AMOVA）

Table 5 Molecular variance analysis (AMOVA) among different populations of L. chinense

变异来源自由度平方和方差分量变异百分率/% 居群间 5 47.1700.294 72 6.09 居群内98445.5234.546 15 93.91

3.4 遗传分化分析

基因多样性是衡量遗传多样性的重要指标。从遗传分化数据来看，6个不同栽培生产区域居群枸杞的t为0.123 1，居群内部s为0.106 2，占86.27%。居群间st为0.137 4，呈现中等程度的遗传分化。m为3.140 3，说明不同栽培生态产区各居群间基因交流和渗透较为充分，在一定程度上降低了居群间遗传分化现象的发生。总遗传多样性仅有13.74%来源于居群间遗传变异，进一步验证群内遗传分化是枸杞遗传多样性的主要因素。

如表6所示，枸杞6个居群的Nei’s遗传相似性在范围为0.835 4～0.890 2，遗传距离范围为0.116 3～0.183 5，各居群间遗传相似性较高。如宁夏银川与新疆精河实际地理距离较远，间隔2000多km，但两地枸杞群体间仍具有高度的遗传相似性（0.887 2）和较小的遗传距离（0.119 7），说明这2个居群间亲缘关系接近，群间变异较小。

3.5 PCoA和聚类分析

以每一个样本名为观测指标，进一步对6个不同栽培生产区域的52份枸杞样本进行PCoA，并构建可视化二维平面图，分析所有样本的整体分布趋势和自然聚集预览，同时采用UPGMA法根据遗传距离构建遗传关系聚类图。

由图3-a所示PCoA图可见，除宁夏产区枸杞样本在第一主成分上主要分布在第一和第四象限外，其他所有样本分区不明显，6个居群的样本间存在大量重叠，没有形成明显的分离群体。类似地，根据遗传距离构建的UPGMA聚类图（图3-b）中，各栽培生产区域的52份枸杞参试样本没有明显的区域趋势和特征，地理距离较近的居群没有优先聚在一起，而是分布在整个聚类图中。还可发现，不同产地的同一品种，如宁杞1号、宁杞5号、宁杞7号等，也没有聚为一簇，而是分散在整个聚类结果中。同时，同一聚类分支中的材料品种和地域分布规律性不明显，有来自于同一地区的，也有来自于不同区域的，有相同品种，也有不同品种，由此形成了相对复杂的遗传关系。这些结果进一步验证了前述遗传多样性和遗传分化的结果，在一定程度上反映出各产地间枸杞居群存在频繁的基因交流，不同栽培产区居群间的地理隔离和遗传分化不明显，导致各地枸杞样本间均质化程度较为严重，存在明显的种质混杂现象。

3.6 群体遗传结构分析

根据在线软件Structure Harvester的计算结果，当=6时，Δ值最低（Δ＝0），此时居群划分结果符合本研究的枸杞居群实际分布情况。Δ值达到最大时，对应的模拟最优群体数＝7，表明本研究中来自不同栽培生产区域的52个枸杞个体DNA样本按照基因型可以分为7种类型，因此在＝7的模式下分析所有枸杞样本的群体遗传结构。从图4-a可以看出，所有参试枸杞样本没有按照地理居群形成明显的分区，不同基因型在各栽培产区居群中均有分布，资源杂合度较高。各产区均有一定数量的单一基因型样本，其中青海德令哈居群单一基因型的比例较高。当按照基因型进行分类时（图4-b），相似的遗传结构类别不具有明显的地理居群特征，各产区样本在不同遗传结构类别中均有分布，同时相同的品种也没有集中排列在遗传结构相似的类别中。

表6 成对的不同栽培生产区域枸杞居群间的遗传相似性和遗传距离

Table 6 Pairwise genetic identity values and genetic distance among different populations of L. chinense

产地宁夏银川新疆精河甘肃玉门甘肃靖远青海德令哈内蒙古巴彦淖尔 宁夏银川****0.887 20.832 30.853 70.850 60.872 0 新疆精河0.119 7****0.841 50.868 90.835 40.887 2 甘肃玉门0.183 50.172 6****0.881 10.872 00.862 8 甘肃靖远0.158 20.140 50.126 6****0.868 90.890 2 青海德令哈0.161 80.179 90.137 00.140 5****0.844 5 内蒙古巴彦淖尔0.137 00.119 70.147 60.116 30.169 0****

Nei’s遗传相似性（上三角）和遗传距离（下三角）

Nei’s genetic identity(above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

图3 不同栽培生产区域枸杞样本间PCoA模型得分散点图(a)和聚类图(b)

图4 按照产区排列(a) 和按照遗传结构相似性排列(b)对不同栽培生产区域枸杞样本遗传结构分析

3.7 遗传距离与地理距离相关性分析

为了解居群遗传距离和实际地理距离间是否存在相关性，进行群体配对遗传分化和地理距离的Mantel分析（图5）。结果显示相关系为＝−0.131（＝0.270），表明我国各产区枸杞居群间遗传距离与地理距离没有显著的相关性，地理距离在枸杞遗传分化中的作用不明显，说明居群间基因交流充分，尚未形成明显的离群群体。

图5 不同栽培生产区域枸杞居群间遗传距离与地理距离相关性

4 讨论

枸杞在我国有着悠久的应用历史。早在两千多年前，《小雅·北山》中就有“陟彼北山，言采其杞”的记载。“神草如蓬世不知，壁间墙角自离离。”野生枸杞自秦汉起开始在民间移植栽种，唐代《千金翼方》中已系统记载了宁夏枸杞的栽培方法[19-20]。宁夏回族自治区是宁夏枸杞的道地产区，所产枸杞子品质上乘，作用广泛而温和，符合“治未病”的健康新模式，不但作为常用大宗药材在临床上发挥重要作用，在民间也有具有极高的认同感和接受度。近年来，随着枸杞子消费市场的持续扩大，我国枸杞栽培地域和面积扩展迅速，在我国宁夏、内蒙、甘肃、青海及新疆等已建成大规模枸杞规范化种植基地，为枸杞的产业化应用提供了良好的生产环境，缓解了枸杞子供应的市场压力，也成为各地发展高效农业和精准扶贫的重要抓手。然而，为满足终端市场对于枸杞子高产、形优等经济性状需求而进行的人工定向选育，使栽培枸杞的遗传多样性逐步下降，如我国各产区枸杞主流栽培品种均以宁杞5号和宁杞7号为主。同时，枸杞是风媒和虫媒同株异序或异株授粉植物，其种子主要依靠鸟类和啮齿类动物传播，使处于较远地理距离的不同居群间保持合理的基因流动，提高居群间遗传多样性，从而促使群内个体发展出更强的适应能力，同时也为创新育种提供更加充裕的资源。然而，发达便利的现代化交通运输，极大地弱化了地理距离带来的阻隔效应，促进了各栽培生产区域间枸杞种质的频繁交流，人为加大了基因流并引起居群内和居群间的种质混杂和均质化。此外，枸杞植株寿命长、自然更新缓慢，加之现代化枸杞种植产业精耕细作，减轻了枸杞野外自然生长环境中的多种逆境胁迫效应，在一定程度上降低了枸杞的遗传多样性。

较低的遗传多样性一方面利于保持药材基原和品质，但另一方面也会由于种质退化而导致耐逆性和稳定性逐渐减弱，不利于物种的延续和进化。因此，为积累丰富的枸杞遗传多样性种质资源，发挥其多方面的潜在优势，在开展枸杞人工种植扩大资源产量、保证供给的同时，加强种质资源保护，根据枸杞生长发育规律和对生长环境条件的要求，模拟原始生态环境进行拟态种植，保障种植枸杞与原产道地枸杞药效相当，是推动我国枸杞产业可持续和高质量发展的必经之路。

本研究采用荧光标记辅助AFLP技术，筛选出10对选扩引物，对来自我国6个枸杞栽培生产区域的52份枸杞材料进行选择性扩增得到328条扩增条带，并根据扩增条带多态性结果判断各DNA样本之间的遗传多样性。结果显示，我国不同生产栽培区域的枸杞居群间存在频繁的基因流，各样本遗传多样性较低，存在较高的遗传均质化现象。本研究结果与余意等[18]通过微卫星序列进行的我国栽培枸杞遗传多样性结果一致。相反的，唐燕等[14]、李彦龙等[15]分别通过表型分析和AFLP进行的研究则表明我国枸杞具有较为丰富的遗传多样性，得到与本研究相反的结论，这种差异可能是由于使用的分子标记及样本采集差异造成的。

本研究供试样本同期进行了基于甲基化敏感扩增多态性技术（methylation-sensitive amplified polymorphism，MSAP）的基因组DNA甲基化水平和模式多样性的差异分析，发现不同栽培生产区域所有样本中非甲基化敏感性位点展示出较低的遗传多样性，这与本研究结果相一致。与此形成鲜明对比的是，甲基化敏感性位点表现出较高的表观遗传多样性和产地内部方差，说明在遗传背景相对稳定的条件下，枸杞基因组发生了较为丰富的表观遗传变异。主成分分析和聚类分析发现各产地枸杞的表观遗传特性各不相同，存在明显的地域相关性，并受到温度、降水量和土壤酸碱度等生态因子的调控[21]。因此推测，遗传背景一致的枸杞经引种栽培至其他生态产区后，通过改变自身DNA甲基化模式及水平，并调控下游相关蛋白质及代谢产物的表达，以提高自身对于不同环境的适应能力，可能是枸杞在不同生态环境下适应能力的内在驱动力。

作为一种较为成熟的群体遗传学分子检测手段，AFLP技术要求足够数量的分析样本，以保证结果的科学性和可靠性。本研究中，受采样规模限制，仅分析了我国6个枸杞主要栽培生产区域的52份枸杞DNA样本，且均采集自人工种植基地，缺少野生枸杞样本。因此，后续还需要对我国枸杞资源分布情况进行深度调查，扩大样本收集范围，并结合形态性状学、内源性代谢成分分析、表观遗传学及其他类型分子标记，以获得更加全面、准确的我国枸杞种质资源遗传多样性研究全景图。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Genetic diversity analysis ofsamples from different cultivation areas based on AFLP molecular markers

ZHANG Fang1, LU Rui-hua1, FU Huan-zhe1, ZHANG Wen-hua2, LI Zhong2, REN Gang3, CHEN Zhan-ping3, ZHAO Yu-ling4, GUO Sheng1, QIAN Da-wei1, DUANJin-ao1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, Nanjing 210023, China 2. Bairuiyuan Gouqi Co., Ltd., Yinchuan 750200, China 3. Haixi Agricultural Science Research Institute of Mongolian and Tibetan Autonomus Prefecture, Delingha 817000, China 4. Jinghe Gouqi Industry Development Center of Bortala Mongolian Autonomous Prefecture, Bortala 833399, China

The genetic diversity of 52samples from six cultivation areas in China was analyzed at the genomic DNA level by using the fluorescence assisted amplified fragment length polymorphism (AFLP) technique.After the successive steps of enzyme digestion, ligation, pre-amplification and selective amplification of the extracted DNA samples, the PCR products were separated by capillary electrophoresis system. The collected data were then analyzed by Popgene software to calculate the genetic diversity parameters, GenAlex software was used to calculate genetic distances and perform principal coordinate analysis, cluster analysis based on genetic distance was performed using MEGA-X software and population genetic structure analysis was performed using Structure software.A total of ten pairs of selective amplification primers were screened, and 328 amplified fragments were amplified, including 121 polymorphic fragments, which were unevenly distributed amongpopulations from different habitats. The genetic diversity ofin different habitats was relatively low. The allele numberN, effective allele numberN,observed heterozygosity, and Shannon information indexwere 1.438 0, 1.231 6, 0.140 7 and 0.215 2, respectively. Nei’s genetic consistency ranged from 0.835 4 to 0.890 2. There were frequent gene exchanges among populations ofin different cultivation and production areas.There were relatively frequent gene exchanges betweenpopulations in different cultivation and production areas, and the degree of genetic differentiation was moderate, and the genetic variation within populations was the main source of genetic variation of. Furthermore, no significant correlation between genetic distance and geographical distance was observed. This study will provide scientific basis for the accumulation of genetic background information, introduction and cultivation, protection of germplasm resources, construction of core germplasm bank and formulation and management of sustainable development strategy of.

L.; amplified fragment length polymorphism; germplasm resources; genetic diversity; cultivation areas

R286.2

A

0253 - 2670(2023)18 - 6074 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.025

2023-02-03

国家自然科学基金资助项目（81773837）；江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目（ZDXM-2020-02，ZDXM-2022-36）；国家中医药管理局中医药创新团队及人才支持计划项目（ZYYCXTD-D-202005）；中央本级重大增减支项目（2060302）；宁夏自然科学基金项目（2022AAC03215）

张 芳，博士，副教授，研究方向为中药生物技术。Tel: (025)85811516 E-mail: fangzhang@njucm.edu.cn

段金廒，教授，博士生导师，研究方向为中药资源化学与资源循环利用。Tel: (025)85811917 E-mail: dja@njucm.edu.cn

[责任编辑 时圣明]