王珊,王雄雄,金珊,刘志华,毛传樨

(湖北大学生命科学学院, 湖北 武汉 430062)

0 引言

微管是由α和β微管蛋白形成的异二聚体头尾相接所构成的13条原纤维纵向排列而成.微管直径为22～25 nm,内径为15 nm,管壁厚度5 nm左右.微管可与其他蛋白共同组装,形成单管、二联管、三联管以及轴突、神经管、纺锤体等结构. α与β微管蛋白结构相似,均能结合GTP,其中,作为固有成分存在的GTP在α-微管蛋白上,不发生交换和水解,而发生水解或交换的GTP则与β-微管蛋白结合.此外还有一种微管蛋白,即γ-微管蛋白,然而它并不是微管的组成部分,但却在微管的组装中起作用.微管的组装整体表现为一个踏车模型(treadmill model)的动态过程,其次它还具有极性.微管正负极的定义是相对的,通常微管的正端是聚合速度大于解聚速度的一端.若解聚速度大于聚合速度,则为负端. 微管末端蛋白在微管的动态聚合中至关重要,微管末端蛋白又分为微管正端蛋白、微管负端蛋白.微管正端蛋白也即微管正端示踪蛋白(+TIPs),+TIPs的成员包括EB系列蛋白(EB1、EB2、EB3)、CLIP170和CLIP115以及p150glued等[1],+TIPs调节微管动态以及微管与细胞皮层、有丝分裂活动或不同细胞器的相互作用[2].与大量被发现的微管正端蛋白不同,目前发现的微管负端蛋白主要有3种,分别是γ-tubulin ring complex、Ninein、CAMSAP/Patronin family.γ-tubulin ring complex主要在微管成核方面起作用,Ninein在微管锚定中起作用,而CAMSAP/Patronin family作用在微管稳定方面[3].在微管上除了各种末端蛋白,还有两个关键的运动蛋白,驱动蛋白(Kinesin)和动力蛋白(Dynein),这两个蛋白都以微管为轨迹来运载“货物”,并且运载的是囊泡和细胞器之类的物质.两种蛋白均需要水解ATP提供能量.此外,Kinesin和Dynein都是单向运输.绝大部分Kinesin以微管正端为导向,由微管负端运输到正端.Dynein则与之相反,由微管正端运输到负端.

微管在细胞中的功能举足轻重.首先,它作为支架参与了细胞形态的维持,其以一定的抗压和抗弯曲能力让细胞拥有了机械支持力,防止了细胞破裂.并且微管对于细胞内细胞器的正确定位不可或缺,微管的稳定性被破坏,会影响高尔基体、线粒体等细胞器在细胞中的正确分布.第二,微管在细胞进行有丝分裂、减数分裂时构成了纺锤体牵引染色体运动.第三,微管是细胞内物质运输的“轨道”,其上的两个运动蛋白Kinesin和Dynein沿着微管进行物质搬运,包括对神经细胞内递质以及胞内色素和小泡的运输.第四,微管还充当了纤毛和鞭毛的运动元件,纤毛和鞭毛的运动原理主要是在动力蛋白水解ATP作用下使相邻的二联鞭毛结构微管相互滑动.总而言之,微管是机体不可或缺的“必需品”,参与了细胞的分裂、运输、运动、形态构成、器官发育等一系列的生物学过程[4],并且微管可存在于哺乳动物除了红细胞外的几乎所有细胞中.

微管的稳定与人体健康密切相关,在癌细胞中,微管稳定性遭到破坏,形态被改变,相较于正常细胞中的微管,癌细胞中的微管短小且排列紊乱,因此,在医学上,可通过微管的形态来判断病人是否患有癌症.近年来,微管与疾病相关联的研究日益增多.最近的几项研究显示,在各种形式的心脏病中,被修饰的微管可以直接阻碍心肌细胞的收缩功能[5];富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)与微管之间的关联被破坏是家族性帕金森病最常见的病因[6];编码微管相关磷酸化蛋白的MAP1B突变导致感觉神经性听力损失[7];动态微管和稳定微管之间的失衡是2,5-己二酮引起神经退行性变的基础[8];微管的组装和动态稳定都受到tau蛋白的调控,而tau蛋白的脱离导致微管的解体,从而引发了阿尔茨海默症[9];线粒体人体肽类似物HNG通过稳定血小板微管而抑制血小板活化和血栓形成[10].种种迹象表明,微管的变化显著影响着机体的健康,本研究通过对果蝇的遗传筛选找出了40个影响微管稳定的调控基因,这些基因将对人类微管相关的疾病治疗提供根本的解决途径.

1 材料与方法

1.1 实验所用果蝇品系见表1.

表1 实验所用果蝇品系

1.2 实验所用抗体及染料见表2.

表2 实验所用抗体及染料

1.3 实验所用解剖液及固定液配制生理解剖液见表3,固定液采用多聚甲醛溶液.

多聚甲醛固定液的配制:①首先配制0.2 mol/L PB (phosphate buffer),称取8.26 g NaH2PO4·2H2O与21.8 g Na2HPO4溶于1 L超纯水中,用NaOH调pH=7.3. ②称取40 g多聚甲醛溶于500 mL水中,60 ℃水浴加热,并不断搅拌,直到澄清;由于加热过程中,多聚甲醛挥发对人体有危害,所以要做好防护措施,佩戴口罩.加热过程中,不宜将加热的玻璃瓶盖子拧紧. ③加入500 mL 0.2 mol/LPB,即为0.1 mol/L PB多聚甲醛溶液,用NaOH调pH=7.2～7.4.

表3 生理解剖缓冲液 HL3.1(pH=7.1～7.3)

1.4 实验方法

1.4.1 果蝇幼虫的解剖方法 ①用镊子将果蝇三龄幼虫夹出,放于滴有解剖液的平皿盖子上,涮洗掉幼虫身上的培养基,轻轻夹起幼虫放于纸巾上吸干身上的解剖液.②将幼虫夹入树脂板解剖盘上,用解剖盘上的解剖针,分别固定住果蝇幼虫的头部、尾部,调整解剖针的位置使幼虫身体充分伸展.③向固定住的幼虫身上加一滴解剖液,完全浸没幼虫.在幼虫头、尾部用解剖剪各开一个横切口,然后用解剖剪从幼虫尾部沿着背中线剪到幼虫头部.④用解剖镊子将幼虫内脏去除干净,注意不要戳到幼虫体壁,保持幼虫肌肉的完整性.⑤用四根解剖针沿着头、尾横切口的两边位置,将幼虫体壁固定成片状,充分伸展,切勿褶皱.解剖针固定过程中尽量保证肌肉结构完整性.

1.4.2 肌肉微管免疫染色方法 ①将解剖好的三龄幼虫,用纸巾吸干解剖液,加入4% PFA固定液覆盖体壁表面,室温下40 min. ②用纸巾吸去固定液,用镊子将固定好的体壁组织转移至2 mL的EP管中,加入0.2% PBST溶液(1× PBS+0.2% TritonX-100),在侧摆摇床上重复用0.2% PBST溶液震荡洗涤,洗涤1 h,此间每10～15 min换一次EP管中的0.2% PBST溶液. ③吸去EP管中的PBST溶液,加入200 μL 0.2% PBST+5%山羊血清,在侧摆摇床上室温封闭40 min. ④吸去封闭液,加入一抗(按比例现配现用,用0.2% PBST溶液配制一抗),在侧摆摇床上,室温孵育3 h,也可将侧摆摇床放入4 ℃冰箱进行过夜孵育. ⑤吸去一抗,在侧摆摇床上重复用0.2% PBST溶液震荡洗涤,洗涤1 h,此间每10～15 min换一次EP管中的0.2% PBST溶液. ⑥吸去洗脱液,加入二抗(按比例现配现用,用0.2% PBST溶液配制二抗),在侧摆摇床上,室温孵育3 h,亦可将侧摆摇床放入4 ℃冰箱进行过夜孵育. ⑦吸去二抗,在侧摆摇床上重复用0.2% PBST溶液震荡洗涤,洗涤1 h,此间每10～15 min换一次EP管中的0.2% PBST溶液. ⑧夹出完成免疫染色的体壁组织,放在载玻片上摆整齐,用纸巾吸干体壁组织,在上面滴加封片油Vector shield,盖上盖玻片(小心操作,不要出现气泡),然后于盖玻片的四周,涂抹适量的指甲油用于密封,写好标记,将做好的样片平放在暗盒里,4 ℃保存或直接用共聚焦荧光显微镜拍摄观察.

1.5 图片采集及处理本实验中所有免疫染色图片的采集,均是通过Zeiss 激光共聚焦显微镜 LSM710和LSM980进行拍摄,为了更好地观察肌肉微管网络,我们均采集果蝇的第4体节2号肌肉上的微管,此处气管相对较少,不易遮挡肌肉细胞,便于观察微管网络.裁剪处理图片则是用 Photoshop CS6 软件.本实验中,筛选微管有表型的基因均重复2次及以上.

2 结果

2.1 运用果蝇三龄幼虫肌肉系统为模型进行微管相关蛋白的筛选本实验利用果蝇三龄幼虫肌肉为模型系统,将清华大学果蝇库RNAi的部分基因的RNAi果蝇株与C57-Gal(肌肉系统特异性表达的Gal4)进行杂交,通过对后代三龄幼虫肌肉的微管进行免疫染色,筛选出对微管网络结构有影响的基因,筛选微管有表型的分类见2.2节.我们用C57-Gal4驱动RNAi果蝇,使果蝇在幼虫时期的肌肉系统中敲减相应的基因,并对其肌肉组织用α-tubulin的抗体进行染色,以此来观察其微管网络的结构,筛选出基因表达下调后,对微管网络有影响的基因.本研究筛选了共计541株 RNAi果蝇,其中微管结构异常的40株,微管结构无表型的496株.有5株RNAi果蝇用C57-Gal4驱动后,果蝇在幼虫期死亡,表明这几种基因对果蝇的发育至关重要,缺失这几种基因对果蝇具有致命性.随着人们对细胞骨架以及对非中心体微管组织中心的逐渐探索,加之其与某些人类疾病的关系密切,人们会更多地去寻求调节微管的相关基因,因此,我们的筛选结果会在一定程度上具有借鉴意义.

2.2 敲除后导致微管网络异常的基因分类对于筛选到微管网络结构异常的RNAi的基因,我们将其表型分为6类,分别是:1)微管轻微断裂;2)微管稀疏;3)微管核周凹陷;4)微管网络密度增大;5)微管严重断裂;6)微管方向异常.此外,我们还单独列出了致死类RNAi的基因,因为其在果蝇三龄幼虫肌肉中表达下调时对果蝇的致命性,提示这些致死类的基因对发育的重要性,并且在人类中的同源基因有极大可能有致病性,甚至与果蝇一样,影响人类存活也未可知.

2.2.1 敲除后导致微管轻微断裂的基因 本实验中筛选到敲除后导致微管网络有表型的基因中,微管断裂是最常见的表型之一.微管轻微断裂表型的基因分别是CG17596、CG8171、CG12051、CG3325、CG3298、CG8230、CG11153、CG33102、CG16858、CG31043、CG5588、CG5272.这些基因功能敲减果蝇的免疫染色微管表型如图1所示.

图1 敲除后微管轻微断裂表型的基因肌肉微管免疫染色图细胞核(蓝色)用核染料Hoechst33342标记,肌肉微管(绿色)用抗体α-tubulin标记(下同).

2.2.2 敲除后导致微管稀疏的基因 微管稀疏表型中也是有轻微的微管断裂的,但并不是主要的微管表型,因此并未将这些基因归为微管断裂类别.筛选到微管变稀疏的RNAi的基因分别是CG16827、CG17271、CG2194、CG31005、CG9168、CG32068、CG10862、CG18628、CG5701、CG4994、CG4379.这些基因功能敲减果蝇的免疫染色微管表型如图2所示,可以看出这些基因的微管与野生型对照相比都有着不同程度的变稀和减少.

图2 敲除后微管稀疏表型的基因肌肉微管免疫染色图

2.2.3 敲除后导致微管核周凹陷的基因 敲除后导致微管核周凹陷表型的基因分别是CG30495、CG4649、CG9027、CG31045、CG14815、CG15002、CG3339.这些基因功能敲减果蝇的免疫染色微管表型如图3所示,可以看出这些基因的微管在细胞核周有一个凹陷.

图3 敲除后导致微管核周凹陷表型的基因肌肉微管免疫染色图图上虚线圈中箭头标识处即为微管在核周凹陷的部位.

2.2.4 敲除后导致微管网络密度增大的基因 敲除后导致微管网络密度增大的基因只筛选到一株,即CG11546.这个基因功能敲减果蝇的免疫染色微管表型如图4所示,它的肌肉微管核周网络密度增大且连成一片.

2.2.5 敲除后导致微管严重断裂的基因 敲除后导致微管严重断裂表型的基因共筛到7个,分别是CG4871、CG1721、CG3697、CG1401、CG7186、CG14258、CG30395.这些基因功能敲减果蝇的免疫染色微管表型如图5所示,可以看出,敲除这些基因后,微管断裂程度较为严重,且微管断裂得比较粉碎.

2.2.6 敲除后导致微管方向异常的基因 微管方向异常表型的RNAi的基因共筛到2株,分别是CG32698和CG9886.这两株基因功能敲减果蝇的三龄幼虫肌肉微管免疫染色如图6所示,可以看出CG32698的微管都是纵向,且肌肉出现萎缩变的狭窄.CG9886则呈现出网格状,由纵向和横向的微管组成.

图6 敲除后导致微管方向异常的基因肌肉微管免疫染色图

2.2.7 敲除后导致果蝇幼虫期致死的基因 敲除后导致果蝇幼虫期致死的基因共筛到5株,分别是CG7834、CG18001、CG44252、CG6859、CG1449.

3 讨论

本实验通过筛选清华大学提供的RNAi果蝇库果蝇,试图找出调控微管的相关基因.具体方法是让基因在果蝇三龄幼虫肌肉组织中沉默表达,免疫染色后观察相关的RNAi的基因在肌肉中特定位置(第四体节二号肌肉)的微管形态.对于没有微管表型的RNAi的基因则放弃筛选,有微管表型的则重复验证表型.本实验共计筛选清华RNAi果蝇541株,其中有肌肉微管表型的40株,此外,还筛选出在幼虫期致死的RNAi的基因5个.在筛选出微管有表型的基因后,我们将其分为6类,分别是减少轻微断裂型、减少变稀型、核周凹陷型、核周聚集网络密度增大型、粉碎严重断裂型、方向异常型.在筛选出的基因中,我们发现了一些与细胞核、高尔基体、线粒体等细胞器相关的基因.例如CG3298编码蛋白Ribonuclease Z,参与核前tRNA加工和线粒体初级转录加工,该基因的人类同源基因与联合氧化磷酸化缺陷有关.CG8230 预测参与高尔基体的组织,该基因的人类同源基因与Dyggve-Melchior-Clausen疾病、Smith-McCort发育不良和软骨发育不良有关.CG11153编码蛋白Sox102F,预测具有DNA结合转录因子活性,参与心脏收缩的正调节,预测定位到细胞核,在中枢神经系统表达.该基因的人类同源基因与老年痴呆症、心脏病和高级别胶质瘤有关.CG9027编码蛋白Superoxide dismutase 3,此蛋白具有超氧化物歧化酶活性,并参与了紫外线防护、超氧自由基的清除等过程,该基因的人类同源基因与动脉疾病、眼科疾病、糖代谢疾病、肺部疾病以及神经退行性疾病有关.CG14815编码蛋白Peroxin 5,参与了过氧化物酶体组织,目前已知定位在细胞质、过氧化物酶体,该基因的人类同源基因与过氧化物酶体生物发生障碍2A及2B、根状软骨发育不良的点状5型有关.筛选中还有一些基因的相关报道较少[11-13],基因的功能也知之甚少,所以这些基因是如何发挥作用调控微管稳定还有待进一步探究.