陆琼 ， 李睿， 宋鸽鸽， 马克学

（1. 漯河医学高等专科学校基础医学部，河南 漯河 462002； 2. 河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007；3. 河南省营养与健康工程研究中心，河南 漯河 462002）

干细胞是动物组织和器官再生的重要细胞来源，但干细胞稳态受到一些外在的（如电离辐射、重金属和药物等）和内在的（如活性氧等）有害因素的影响（Cieślar-Pobudaet al.，2017；Salvettiet al.，2020）。因此，干细胞维持在细胞世代中的稳定性和持续的自我更新能力必然受到一系列蛋白质的保护（Fan，2012）。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一类在细胞应激状态下表达的蛋白质，研究发现该类蛋白质在各类干细胞中高表达，对维持干细胞内的稳态具有重要的保护作用（Shendeet al.，2019）。淡水涡虫作为研究再生的经典模式动物，逐渐受到国内学者的广泛关注（王志红等，2019；马克学等，2021；张芬熙等，2021）。涡虫强大的再生能力基于其体内被称为“Neoblasts”的多能干细胞（宇文延青等，2016；Reddien，2018），它可以分化形成神经细胞、肌肉细胞、肠道细胞和表皮细胞等。HSP60是热休克蛋白家族中的重要成员，研究发现其对鱼鳍再生及造血干细胞、胚胎干细胞的稳态维持很重要（Makinoet al.，2005；Seoet al.，2018；Choiet al.，2022）。但HSP60 在涡虫再生中的研究还不深入。本文从日本三角涡虫Dugesia japonica中克隆了HSP60 的cDNA 全长序列，初步研究了其在涡虫再生中的表达模式，以及干扰HSP60 表达对涡虫再生的影响。上述工作为深入研究HSP60 在涡虫再生和抗逆性中的作用机制奠定了良好基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

日本三角涡虫为本实验室无性繁殖获得的单克隆品系，18 ℃避光培养，每2周喂食一次牛肝，实验前至少饥饿1 周。再生用涡虫沿咽前咽后切割成3段，置于20 ℃培养，分别于再生1 d、3 d、5 d、7 d 收集涡虫提取RNA 和进行原位杂交实验，以整体涡虫为对照。

1.2 总RNA提取和Djhsp60 cDNA克隆

将涡虫于液氮中研磨成粉末后加入Trizol 试剂，按照试剂盒操作说明提取总RNA，然后将总RNA 反转录成cDNA，并以此为模板进行PCR 扩增。根据本实验室筛选的Djhsp60EST 序列设计3’-RACE 和5’-RACE 特异性引物（表1），按照RACE cDNA 试剂盒（Clontech）进行PCR 扩增。PCR 片段经纯化后连接pMD19-T 载体，筛选阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司测序分析，根据测序结果拼接出Djhsp60全长cDNA序列。

表1 本实验所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 Djhsp60基因组结构分析

根据Djhsp60cDNA 全长序列，设计1对特异性引物（表1），以DNA为模板进行PCR扩增。PCR片段经纯化后连接pMD19-T 载体，筛选阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司测序分析。通过比较Djhsp60基因DNA序列和cDNA 序列即可获得基因组内含子信息。

1.4 生物信息学分析

序列同源性比对和相似性搜索在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行，多序列比对采用DNAMAN6.0，开放阅读框预测和氨基酸序列分析采用DNAstar 5.0，蛋白质结构域分析采用Expert Protein Analysis System（http：//www.expasy.org），HSP60 亲缘关系树采用Clustal x 1.83 和Mega 3.1构建，以人Homo sapiens为外群，系统树各分支的置信度由Bootstrap 1 000次循环检验。

1.5 qPCR分析

总RNA 提取和cDNA 合成同前。PCR 反应体系为20 μL：2×TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（ROX plus）10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 模板1 μL，灭菌超纯水7.4 μL。PCR反应在ABI 7500系统中进行：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40个循环。以持家基因Djef2为内参，以2–ΔΔCT法计算mRNA 相对表达量，实验重复3 次。采用SPASS 10.0进行单因子方差分析，P<0.05表示差异显著。

1.6 整体原位杂交和双荧光原位杂交实验

整体原位杂交根据King 和Newmark（2013）的操作并稍作修改，主要实验步骤如下：1、涡虫用2%HCl 处死后立即用4%甲醛溶液固定30 min；2、样品经50%甲醇溶液和100%甲醇洗涤后，−20 ℃冻存24 h；3、样品经过含6%H2O2的甲醇溶液漂白过夜；4、样品经PBST 洗涤后用蛋白酶K 处理，然后用4%甲醛溶液固定30 min；5、样品经PBST 洗涤后加入预杂交液，然后加入杂交液，56 ℃杂交>16 h；6、样品经过充分洗涤后加入anti-DIG-AP抗体，4 ℃孵育过夜，杂交信号用BCIP/NBT显色，Leica DFC300FX 显微镜拍照后用Adobe Pho⁃toshop处理。

双荧光原位杂交实验样品处理步骤同前，杂交液中含Dig-标记的Djhsp60探针和Fluorescein-标记的DjwiA探针。杂交完成样品洗涤后先用anti-DIG-POD（1∶2 000 稀释；Roche，Catalog No. 11207733910）抗体4 ℃孵育过夜，用Rhodamine-tyramide避光显色。样品再次洗涤后用anti-fluorescein-POD（1∶2 000 稀释；Roche，Catalog No. 11426346910）抗体4 ℃孵育过夜，用FITC-tyramide 避光显色。蔡司体式荧光显微镜（Axio Zoom. V16）拍照后用附带的软件处理。

1.7 RNAi实验

双链RNA（dsRNA）的合成按照Rouhana 等（2013）提供的方法进行。将合成的10 μg dsRNA与20 μL 牛肝匀浆混合后，喂食25 条左右长度为3～4 mm 涡虫，间隔3 d 喂食一次，共喂食5 次。以GFP dsRNA 作对照。当涡虫头部开始退化时切割涡虫观察再生表型，用Leica DFC300FX 显微镜拍照，图片用Adobe Photoshop 处理。收集再生5 d 的个体用于qPCR检测和原位杂交实验。

2 结果

2.1 日本三角涡虫hsp60基因的分子特征

采用RACE 技术获得日本三角涡虫hsp60基因的全长cDNA 序列1 851 bp，5’-有50 bp 的非翻译区，3’-有73 bp 的非翻译区并含有polyA 尾，在polyA 尾上游14 bp 处可见AATAAA 的加尾信号（图1）。将该序列命名为Djhsp60，并在GenBank 注册（GenBank 登录号：MH509193）。Djhsp60基因的开放阅读框长度1 728 bp，编码575个氨基酸，分子量61.7 kD，理论等电点5.79。DjHSP60 的蛋白质序列中N 端含有进入线粒体的导肽序列，C 端含有典型的GGM 重复序列，中间区域含有HSP60 蛋白家族高度保守的标签序列（AAVEEGIVPGGG）和ATP 结合结构域。亚细胞定位分析显示（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/），该蛋白定位于线粒体，属于线粒体HSP60 蛋白家族。此外还测序了Djhs60的DNA 序列，发现该基因结构区仅有1 个内含子，位于第56 位赖氨酸密码子AAA 和第57 位甘氨酸密码子GGT 之间，内含子的5’-和3’-拼接位点符合典型的“GT-AG”法则（图2）。

图2 Djhsp60基因结构（方框示内含子）Fig. 2 Structure of Djhsp60 gene （intron between AAA codon and GGT codon was boxed）

图3 基于邻接法建立的扁形动物门HSP60家族亲缘关系树Fig. 3 Phylogenetic tree of HSP60 family members from Platyhelminthes based on the Neighbour-Joining

2.2 DjHSP60的亲缘关系分析

NCBI Blast 检索分析显示，DjHSP60 氨基酸序列与已经报道的脊椎动物和无脊椎动物HSP60s的氨基酸序列高度同源，与人、小鼠Mus musculus和斑马鱼Danio rerio的同源性分别是71.4%、71.8%和71.7%，与果蝇Drosophila melanogaster和日本血吸虫Schistosoma japonicum的同源性分别是73.4%和78.9%。地中海涡虫Schmidtea mediterranea基因组数据库（http：//smedgd.neuro.utah.edu）的检索结果显示，其同源性基因Smedhsp60编码的也是575 个氨基酸的蛋白质，与DjHSP60 的一致性为95.1%。HSP60 亲缘关系树显示，所有的吸虫和绦虫分别聚类形成2个独立的姊妹分支，而自由生活的涡虫则从寄生虫中独立出来形成一个单独的分支，与人的亲缘关系更近。

2.3 Djhsp60的表达模式分析

整体原位杂交显示，Djhsp60阳性细胞在除咽以外的组织中均有表达（图4：A），尤其是在实质组织中表达量较高，且阳性细胞成簇分布（图4：A1）。双荧光原位杂交显示，Djhsp60与涡虫干细胞marker基因DjwiA的表达模式非常相似，存在明显的共表达现象（图4：B）。原位杂交显示，涡虫再生1 d，Djhsp60的阳性表达信号在伤口下的组织中显著增强（图4：C）。随再生进行，Djhsp60的阳性表达信号逐渐减弱（图4：C）。qPCR 检测结果显示，与对照组相比，Djhsp60表达量在再生1 d后升高了约5.3 倍，然后随再生进行表达量逐渐下降（图4：D）。

图4 Djhsp60的表达模式Fig. 4 Expression pattern of Djhsp60

2.4 干扰Djhsp60对涡虫再生的影响

干扰20 d 后，涡虫头部逐渐退化直至消失（图5：A1～A3）。进一步研究发现，干扰组涡虫丧失了再生能力（图5：B1～B4）。qPCR 检测结果显示，干扰后内源性Djhsp60表达量降低了约60%（图5：C1）。原位杂交结果显示，干扰后的虫体Djhsp60转录本的表达信号显著减少（图5：C2、C3）。

图5 干扰Djhsp60对涡虫再生和组织稳态的影响Fig. 5 Effects of RNAi-Djhsp60 on planarian regeneration and homeostasis

2.5 干扰Djhsp60 对涡虫干细胞相关基因表达的影响

原位杂交结果显示，干扰组几乎检测不到涡虫干细胞标志基因DjwiA的阳性表达（图6：A）。

图6 干扰Djhsp60对涡虫干细胞相关基因表达的影响Fig. 6 Effects of RNAi-Djhsp60 on the expression of planarian stem cell-related genes

qPCR 结果显示，干扰组涡虫DjwiA的表达量是对照组的0.18 倍，表达量减少约80%；其他涡虫干细胞marker 基因Djmcm2、Djpcna和Djh2b的表达量也显著降低，分别是对照组的0.25 倍、0.33 倍和0.13倍（图6：B）。

3 讨论

HSP60是热休克蛋白家族中的重要成员，主要分布在线粒体，对线粒体稳态的维持发挥重要作用（Duanet al.，2020）。Seo 等（2018）发现，HSP60在干细胞中表达较高，参与干细胞增殖的调控。淡水涡虫是研究再生的经典模式动物，涡虫再生依赖其体内的多能干细胞。已有研究发现，一些热休克蛋白家族成员如HSP90、HSP70和HSP40在涡虫干细胞表达且是涡虫再生所必需的基因（Donget al.，2018；Wanget al.，2019；Wanget al.，2022）。但HSP60 在涡虫中的研究较少。本文首先采用RACE 技术从日本三角涡虫中克隆出hsp60基因的全长cDNA 序列，并推导出其编码的氨基酸序列。经检索分析，无论是核苷酸序列还是蛋白质序列，都与目前报道的HSP60 高度同源，且DjHSP60 含有HSP60 家族的标签序列和C-端高度保守的GGM 重复序列。研究还发现，Djhsp60仅含有1 个内含子。内含子少便于转录本的快速加工剪切，以应对环境应急做出快速反应，这可能是涡虫热休克蛋白基因的共性特征（马克学等，2013；Maet al.，2014）。HSP60 系统进化树显示，涡虫比绦虫和吸虫更接近人类，这与最新提出的涡虫的分类地位一致（陈广文，马克学，2008）。

涡虫干细胞属于未分化细胞，主要在实质组织中分布。而高度分化的组织如肌肉质的咽中的干细胞较少。本研究发现，Djhsp60转录本主要在皮下实质组织中表达，且成簇分布，与Orri 等（2005）报道的涡虫干细胞分布模式非常相似。此外，Djhsp60与涡虫干细胞marker 基因DjwiA共表达。且地中海涡虫信息学数据库（https：//plano⁃sphere.stowers.org/feature/Schmitea/mediterranea-sex ual/transcript/SMED30025522）检索表明，HSP60 在Smedwi‑1（地中海涡虫干细胞标志基因，与DjwiA同源）阳性细胞中表达，进一步说明Djhsp60阳性细胞具有干细胞的特征。涡虫切割后1 d，Djhsp60强阳性表达信号出现在伤口下组织中，说明此处干细胞增殖活跃，急需产生大量的新生细胞来再生出缺失的组织和器官。随涡虫再生进行，新再生组织（如前端头部）细胞逐渐分化，Djhsp60阳性表达信号逐渐减弱。这种表达模式与Seo 等（2018）报道的基本一致，即HSP60 在干细胞中的表达量高而在分化细胞中表达量低，敲除HSP60 表达影响干细胞增殖。本研究还发现，干扰后的涡虫耳突结构消失、头部逐渐退化。干扰Djhsp60的表型与干扰地中海涡虫干细胞标志基因Smedwi‑1的表型非常相似（Reddienet al.，2005）。因为涡虫耳突前的组织缺乏干细胞，干扰很可能影响了涡虫干细胞的增殖，导致头部组织不能有效地进行细胞更新，所以干扰后涡虫头部组织逐渐退化消失。此外，干扰后绝大多数虫子丧失了再生能力，进一步说明干扰很可能影响了干细胞的功能。原位杂交和qPCR 技术研究干细胞相关基因的表达变化，结果发现，干扰后涡虫干细胞相关基因的表达量极显著降低。上述研究表明，Djhsp60属于涡虫干细胞相关基因，在涡虫再生和组织稳态维持中发挥重要作用。

本文报道了日本三角涡虫HSP60 的核苷酸序列和氨基酸序列，初步研究了其表达谱和干扰其表达对涡虫再生的影响，为进一步深入研究其在涡虫再生和环境应激反应中的作用奠定了良好基础。