麦东媚 沈乐 谭俊青

1广东省第二中医院检验科，广州 510000；2广东江南医院检验科，广州 510000

近年来，我国鼻咽癌人数不断上涨，特别是两广地区，鼻咽癌趋势更是由北向南逐渐递增。据研究，我国鼻咽癌发病人数占世界鼻咽癌患者的38.29%，鼻咽癌致死人数占世界鼻咽癌死亡人口的40.14%，发病率和病死率高于世界平均水平（1.2/10万、0.7/10万），且男性患鼻咽癌的比例远高于女性［1］。其中，EB病毒与鼻咽癌有着密不可分的联系，EB病毒衣壳抗原抗体（epstein-barr virus capsid antigen antibody，EBV-VCA-IgA）和 EB病毒早期抗原抗体（epstein-barr virus early antigen antibody，EBV-EA-IgA）水平抗体与鼻咽癌临床表现有一定相关性，可应用于鼻咽癌的诊疗［2］。但鼻咽癌预后和治疗情况复杂，患者治疗后体内的EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA和EBV-DNA水平会大幅减少，导致检出率大幅度下降，这时候要通过这三项联合检查才能为鼻咽癌疗效及预后提供一定的参考意义［3］。广州地区是鼻咽癌高风险地区，所以能够有一个准确检测EBV-VCA-IgA与EBV-EA-IgA的指标对快速确诊鼻咽癌与观察鼻咽癌的治疗愈后具有重要意义。

过去临床实验室是通过定性试验确认机体是否感染有EB病毒的风险，这种方法存在假阴性或假阳性的可能，无法对患者体内EB病毒进行准确检测。近几年，临床实验室对EB病毒的定性试验转变为定量试验。这种定量试验可以更精准检测患者体内的EB病毒抗原抗体含量，反应机体感染病毒的严重程度，为临床筛查与治疗提供更为准确的检测结果。但是这种定量试验运用到临床检验上的时间并不长，大多数临床实验室还是直接使用试剂商提供的EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA的参考区间。由于广州地区居民的饮食、环境、生活习惯的不同，无法准确验证试剂厂商提供的参考区间是否适用于广州地区的居民［4］。因此，建立适用于本实验室的EBV-VCA-IgA与EBV-EA-IgA的生物参考区间具有一定的临床指导意义。

运用直接法去建立当地的生物参考区间［5］，于各地医院是一个十分重要的诊断指标，但需要严格筛查患者样本，程序复杂，十分费时且花费大，这对于医学实验室来说是一种巨大的负担。而间接法建立生物参考区间是指运用临床实验室数据库中已有的数据去建立生物参考区间的方法，相比于直接法，间接法更加方便、快速，为不同地区和不同等级的临床实验室降低了建立生物参考区间的难度［6］。因此，本次研究将运用间接法，通过收集并筛选广东省第二中医院2020年8月至2021年7月体检健康人群的数据，建立本实验室EBV-VCA-IgA及EBV-EA-IgA的生物参考区间，并参考WS/T 402—2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》中推荐的方法［7］，选取广东省第二中医院2021年8月至10月的体检健康人群参与验证，按照本文研究数据的筛选标准筛选出参考区间对应的验证数据，从中随机取20个标本对其参考区间进行验证，建立临床较为适用的参考区间，提高临床对EB病毒感染的确诊率与及时反馈鼻咽癌患者的预后情况。

材料与方法

1.分析对象

研究所用到的体检标本均来自广东省第二中医院实验室信息管理系统（laboratory information management system，LIS）中2020年8月至2021年7月的体检标本，运用Excel软件筛选体检标本信息中同时检测了EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA、血清天冬氨酸转氨酶（AST）、血清丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆红素（T-BILI）、直接胆红素（D-BILI）、间接胆红素（I-BILI）、血清肌酐（CR）及尿素氮（BUN）等的标本，共计有2 160例符合要求的体检标本，其中男998例，女1 162例。本次研究仅对大于20岁、小于100岁的成年人进行研究。筛查标准：（1）体检标本；（2）信息完整；（3）EB两项（EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA）、肝功五项（ALT、AST、T-BILI、I-BILI、D-BILI）、肾功二项（CR、BUN）结果正常的体检标本。按年龄段区分为3个年龄组：20～50岁组、≥50～70岁组以及≥70岁组。20～50岁组1 135例，男558例，女 577例；≥50～70岁组 807例，男 359例，女448例；≥70岁组218例，男81例，女137例。

本研究经广东省第二中医院医学伦理委员会审核批准，意见号：Z202303-004-01。

2.仪器与试剂

新产业MAGLUMI X8化学发光免疫分析仪、EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA抗体检测试剂盒均购自深圳市新产业生物医学工程股份有限公司。

3.方法

3.1.质量控制 为了保证本次实验数据准确可靠，必须要确认实验所需要的仪器与试剂室内质控情况。经检测得出一份关于EBV-VCA-IgA/EBV-EA-IgA性能验证报告，EBV-VCA-IgA的实验室变异系数（%）为Level 1（低水平）：3.978%，Level 2（高水平）：2.337%；EBV-EA-IgA的实验室变异系数（%）为Level 1（低水平）：6.078%，Level 2（高水平）：4.131%。以上两项目的变异系数都低于厂商提供的变异系数10%，证明本次结果均符合实验室中的质控标准。

3.2.数据导出 体检标本包括EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA、ALT、AST、T-BILI、I-BILI、D-BILI、CR、BUN的体检标本信息、性别以及检测结果，并且以患者ID号为唯一标准，删除重复与信息缺失的数据结果。

3.3.数据剔除 运用K-S检验对各性别组以及年龄组进行正态性分析，P＞0.05为正态分布，P＜0.05为非正态分布。对于非正态分布的组别需要用非参数法进行检验，运用统计学分析得出各组别的上下四分位数（P75，P25），计算各组的四分位间距（IQR），并且绘制箱式图，剔除大于P25-3×IQR和小于P75+3×IQR的数据。

3.4.数据分组 对EB病毒的两个检测项目先进行性别分组，两组比较使用Mann-WhitneyU检验，再进行年龄分组，年龄组分为20～50岁组、≥50～70岁以及≥70岁这3个组别（各组数据均符合WS/T 402-2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》中规定最少检测数量为120例）［7］。3组及以上使用Kruskal-Wallis（K-W）秩和检验，3组及以上的两两比较使用DunnettT3检验。对差异无统计学意义（P＞0.05）的年龄组进行合并分析，若再无统计学意义便暂时不考虑建立该组的生物参考区间。对差异有统计学意义（P＜0.05）的年龄组分别建立生物参考区间。

3.5.建立生物参考区间 根据性别与年龄组进行分组筛选，对结果进行正态性检验，比对组间VCA-IgA和EA-IgA的水平是否存在差异。绘制箱式图对于非正态分布的结果进行离群值的剔除后，选用非参数法检验计算出第2.5个百分位数（P2.5）作为VCA-IgA和EA-IgA生物参考区间的上限值，第97.5个百分位数（P97.5）作为VCA-IgA和EA-IgA生物参考区间的下限值。

3.6.验证生物参考区间 参照WS/T 402-2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》中推荐的方法［7］，随机抽取20例2021年8月的体检健康人群标本进行验证，如果检测结果中有90%以上的结果均分布在新建立的参考区间范围内，则证明该生物参考区间适用。如果第1次试验不通过验证，则需要重新筛选20例标本进行2次验证，如再次验证失败，证明该生物参考区间不适用。

4.统计学方法

运用 SPSS 20.0中的 Kolmogorov Smirnov（K-S）检验对各性别组以及年龄组进行正态性分析，P＞0.05为正态分布，P＜0.05为非正态分布，得出的结果结合K-S检验的统计结果可分析出，男女性别组及年龄组的检验结果是否为正态分布，如数据分析后呈正态分布，则可以使用参数检验对其进行分析；若结果非正态分布，则使用非参数检验中Mann-WhitneyU检验分析男女性别差异是否有统计学意义，再绘制箱式图，剔除离群值。男女性别组间比较使用Mann-WhitneyU检验；年龄组间比较则使用非参数检验中K-W秩和检验法并使用Dunnett T3法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义

结 果

1.各项数据的分布情况

将筛查分类后的各组EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA数据进行K-S检验，结果如图1～3所示，各组数据均呈偏态分布，使用非参数检验法。同时，建立各组数据的箱式图，根据箱式图剔除离群值，用非参数检验各组间差异。

图2 2 189例健康体检人群按年龄分组的EB病毒早期抗原抗体（EBV-EA-IgA）、EB病毒衣壳抗原抗体（EBV-VCA-IgA）数据直方图。A为20～50岁组EBV-EA-IgA数据，B为20～50岁组EBV-VCA-IgA数据，C为≥50～70岁组EBV-EA-IgA数据，D为≥50～70岁组EBV-VCA-IgA数据，E为≥70岁组EBV-EA-IgA数据，F为≥70岁组EBV-VCA-IgA数据

图3 EB病毒衣壳抗原抗体（EBV-VCA-IgA）男女年龄组数据的直方图。A为20～50岁组男性EBV-VCA-IgA数据，B为20～50岁组女性EBV-VCA-IgA数据，C为≥50～70岁组男性EBV-VCA-IgA数据，D为≥50～70岁组女性EBV-VCA-IgA数据，E为≥70岁组男性EBV-VCA-IgA数据，F为≥70岁组女性EBV-VCA-IgA数据

2.分析性别组间的参考区间

运用Mann-WhitneyU检验，对EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA性别结果分别进行分析，结果显示EBV-VCA-IgA 性 别 差 异 有 统 计 学 意 义（P＜0.001），EBV-EA-IgA性别差异无统计学意义（P=0.127），证明EBV-VCA-IgA的生物参考区间需要区分性别。

3.分析各项目年龄组间的参考区间

EBV-EA-IgA性别差异无统计学意义，EBV-VCA-IgA男女性别间差异有统计学意义。因此，EBV-EA-IgA项目按20～50岁、≥50～70岁及≥70岁分成3组，EBV-VCA-IgA项目在性别分组的基础上分别按20～50岁、≥50～70岁及≥70岁分成3组。将各个项目的年龄组间进行非参数检验中独立样本K-W秩和检验法得出，EBV-VCA-IgA、EBV-VCA-IgA男性、EBV-VCA-IgA女性年龄组别间，差异均无统计学意义（P=0.087、0.294、0.087），所以不需要建立年龄分组的参考区间。仅有EBV-EA-IgA年龄组之间差异有统计学意义（P=0.004），即EBV-EA-IgA年龄组需要将其分别进行参考区间的建立。接着，使用Dunnett T3法对EBV-EA-IgA的年龄分组进行两两比较。如图4所示，20～50岁与≥50～70岁组之间，差异无统计学意义（P＞0.05），其他两两比较差异均有统计学意义（P=0.002、P＜0.001），故合并为一组（20～70岁），与≥70岁组比较，差异有统计学意义（P=0.001）。

图4 2 189例健康体检人群按年龄分组后组间EB病毒早期抗原抗体（EBV-EA-IgA）比较

另外，通过拟合线性的散点图（图5）可以看出，EBV-EA-IgA随年龄增长其检测值有所增高，主要反映在女性人群。而EBV-VCA-IgA无论男性或女性均无明显趋势。

图5 各项目组的拟合线性散点图。A为2 160例健康体检人群的EA-IgA拟合线性散点图，B为男性的EA-IgA拟合线性散点图，C为女性的EA-IgA拟合线性散点图，D为2 160例健康体检人群的VCA-IgA拟合线性散点图，E为男性VCA-IgA拟合线性散点图，F为女性的VCA-IgA拟合线性散点图

4.生物参考区间的建立

由于此次建立生物参考区间是使用的间接法，所以要使用非参数检验对本次结果的2.5百分位数和97.5百分位数的数据作为生物参考区间。离群值经剔除后，对差异有统计学意义的组别进行P2.5和P97.5分布点位的计算，根据百分位数（P2.5～P97.5）建立各个组别的生物参考区间，分别是EBV-VCA-IgA：男性0.34～3.88 AU/ml，女 性 0.32～3.71 AU/ml；EBV-EA-IgA：20～70 岁 ：0.01～1.39 AU/ml，≥70岁：0.01～1.52 AU/ml（厂家提供的生物参考区间EBV-VCA-IgA为0～4、EBV-EA-IgA为0.00～3.00）。

5.生物参考区间的验证

使用随机抽样法抽取2021年8月至10月的符合条件的体检标本，对有年龄分组的生物参考区间进行年龄分层随机抽样法抽取体检标本，对有性别分组的生物参考区间进行性别分层随机抽样法抽取体检标本。为各组的生物参考区间随机抽取20例标本进行验证，验证以18个以上的结果在建立的参考区间内为通过，验证次数不能多于2次。运用Excel软件，进行验证各组参考区间的可靠性，EBV-VCA-IgA男性组、EBV-VCA-IgA女性组、EBV-EA-IgA 20～70岁组、EBV-EA-IgA≥70岁组的生物参考区间通过验证要求。所以，此次研究建立的生物参考区间验证通过，符合临床实验室标准要求。

讨 论

使用直接法建立的生物参考区间相对间接法来说更可靠且适用，这也是国际临床实验室标准推荐的建立生物参考区间方法［5］。但对直接法来说，健康人群选择是一个很复杂的问题，根据不同项目组合去筛选健康人群与因不同疾病在不同人群中产生的亚临床状态，这些细微的差异都会直接引起生物参考区间的差异。长此以往，诸多不便利的因素使国内的临床实验室仍在使用试剂厂商提供的参考区间，特别是购入国外厂商的试剂，他们是根据外国人的身体检查数据所建立的生物参考区间，与国内人群因饮食、文化、生活环境的差异导致两者会产生两种截然不同的参考区间。在Fraser［8］报道中，也指出了各个项目的生物参考值并不是一个固定的常数，其中生物与生俱来的变异性对每个临床检验项目都造成了一定影响。我国卫生部门在2012年颁布了一套生化与血常规部分项目的标准后，国内的临床实验室才有了较为规范的行业标准。

用间接法建立生物参考区间需要以大量数据为基础，所以，这次使用的体检人群数据结果会存在一定数量的离群值，间接法的弊端之一就是离群值［9］。建立参考区间需要将离群值剔除，本次实验数据均为非正态分布，采用箱式图将离群值剔除。观察近几年各文章所使用的方法［10-11］，不同剔除方式都有不同的适用范围，应根据数据的分布与数量进行筛选合适的剔除方式。本研究采取了大于P25-3×IQR和小于P75+3×IQR作为数据剔除标准。

广州是鼻咽癌高风险地区，EB相关定量检测的生物参考区间建立未见相关报道。因此，本次研究的主旨在于能够初步建立本实验室EBV-VCA-IgA及EBV-EA-IgA定量检测的生物参考区间。检测EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA等EBV相关抗体是筛查和辅助诊断常用方法。对于EB病毒抗原抗体来说，其临床意义在于当检测的数值高于参考区间提供的上限时，提示机体可能存在潜在的鼻咽癌风险或反映鼻咽癌的治疗预后效果［12］。所以EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA的参考区间上限比下限更具有临床意义，与厂家推荐的参考区间上限进行比较，发现新建立的参考区间范围更加精准，测量范围更小。

本研究发现，EBV-VCA-IgA在性别分组差异有统计学意义，并且男性的参考范围上限值比女性偏高。另外，EBV-VCA-IgA在年龄分组上差异无统计学意义，故未作下一步分组。EBV-EA-IgA在性别分组上差异无统计学意义。据研究，EBV-EA-IgA在不同年龄段的阳性率差异有统计学意义，其中，中老年区间EBV-EA-IgA的阳性率较高［13］。这与本文研究结果一致，EBV-EA-IgA在年龄分组上差异有统计学意义，并划分了20～70岁及≥70岁的年龄段参考范围，并呈现出随着年龄增长而增长的趋势（图4），提示EBV-EA-IgA在健康人群中可能会随着年龄的变化而变化。因此，对于不同年龄段的人群可能应选择不同的诊断界值，才能提高患者的诊断率。而EBV-VCA-IgA不会因年龄的变化而大幅度波动（图4），因此不需要建立年龄分组的参考区间。

据李晓华等［14］报道，健康人群中EBV-VCA-IgA的男女间rA值比较差异无统计学意义，与本文研究的结果不一致。分析原因如下：一，检测方法不一致，李晓华等研究的方法是ELISA（定性），而本文研究的是化学发光法（定量）；二，本研究无法完全筛除体检标本中可能存在的慢性病、遗传病以及各类疾患等；三，标本数量不够多，无法抹去因实验数据不足带来偏移的可能；四，在用间接法建立生物参考区间时，我们没有使用两种或以上的检验方法，以得出更符合临床实验室的生物参考区间。另外，我们分析数据发现EBV-VCA-IgA的男女参考区间上限值差异不大。考虑到分组的意义，其性别分组的参考区间尚待进一步完善和验证。

结 论

目前，大部分医院检验科的信息化建设已逐渐完善，利用间接法验证和建立参考范围的条件已逐渐成熟。本研究利用间接法初次建立本实验室EBV-VCA-IgA与EBV-EA-IgA的生物参考区间，结果表明，厂家推荐的参考区间可能不适用于所有地区及人群，利用实验室大数据进行参考区间的建立和验证具有一定的研究价值。本研究得出的EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA性别及年龄分组的参考区间具有一定的实际意义与参考价值。但由于标本数量不足、筛选标准不够严格等，无法建立更精确的生物参考区间。同时，单一的方法学检验存在的缺陷，也没有使用其他检验方法进行弥补。所以，此次建立的生物参考区间不够完善，为本实验室提供更为准确的EBV-VCA-IgA与EBV-EA-IgA生物参考区间还需要进一步完善和验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明麦冬媚：酝酿和设计试验，起草文章，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析；沈乐：采集数据，分析/解释数据；谭俊青：指导，支持性贡献