尹梦颖，王 颖，戴玙格，李欢欢，范文莹

（湖北文理学院食品科学技术学院，湖北襄阳 441053）

0 引言

咖啡因（C8H10N4O2）是一种甲基黄嘌呤的生物碱，其化学名是1,3,7 -三甲基黄嘌呤或3,7 -二氢-1,3,7 -三甲基-1H -嘌呤-2,6 -二酮，可以从茶叶、咖啡果等植物中提炼而得，也可以通过化学合成进行制备[1-3]。适量使用咖啡因可以起到祛除疲劳、兴奋神经的作用，在临床上常用来治疗神经衰弱、昏迷复苏的症状。但是，大剂量或长期使用咖啡因会损害肝、胃、肾等内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，并且易引发成瘾性，一旦停止使用就会出现精神萎顿、浑身乏软等各种戒断症状，甚至导致吸食者下一代智力低下、肢体畸形等严重问题[1]。因此，咖啡因被列为受国家管制的精神药品[4]。咖啡因的摄入量可分为以下等级：成人每天摄入80～250 mg 咖啡因（1.1～3.5 mg/kg·d-1）为低摄入量，300～400 mg（4～6 mg/kg·d-1）为中摄入量，超过500 mg（7 mg/kg·d-1）为高摄入量[5-7]。

茶叶是中国传统饮品，品种产地各不相同，咖啡因含量也存在差别。由于茶叶中咖啡因的摄入主要通过开水浸泡溶出，因此冲泡次数对茶叶中咖啡因的释放量存在影响，研究泡茶过程对茶水中咖啡因释放量的影响对健康饮茶具有重要意义。高效液相色谱法是在经典液相色谱法的基础上发展而来的色谱分离技术，根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离，具有高柱效、速度快、分辨率高、灵敏度高、柱子可反复使用、样品量消耗少、易回收等优点[8-16]。

因此，以保康产地绿茶为研究对象，建立了高效液相色谱分析方法用于研究泡茶过程对保康产地茶叶中咖啡因释放量的影响。对高效液相色谱分离检测条件进行了优化考查，并对分析性能进行评价，将其用于考查泡茶过程对咖啡因释放量的影响，从而为健康泡茶饮茶提供建议。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

保康茶叶，产自湖北省襄阳市保康地区；咖啡因标准品，南京森贝伽生物科技有限公司提供；甲醇（色谱纯）、乙酸（分析纯），西陇科学股份有限公司提供；超纯水。

准确称取10.0 mg 咖啡因标准品，用甲醇溶解定容至10 mL，配制为1 000 mg/L 的咖啡因母液，置于-4 ℃中冰箱冷藏备用。不同浓度的咖啡因标准溶液均由1 000 mg/L 咖啡因母液经超纯水逐级稀释定容而得。

1.2 仪器及设备

LC-20ADXR 型高效液相色谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司产品；AL204 型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品；KQ-500E 型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司产品；便携真空泵，武汉恒信世纪科技有限公司产品。

烧杯、玻璃棒、容量瓶、量筒、移液枪、称量纸、0.45 μm 微孔滤膜、砂芯过滤装置、注射器等。

2 试验方法

2.1 高效液相色谱条件优化

选择ODS-C18型反相柱（4.6 mm×150.0 mm，5 μm）为分离色谱柱，甲醇∶0.05%乙酸水溶液的混合溶液为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测器为SPD-M20A 紫外检测器，进样量20 μL。分别对流动相比例和检测波长进行优化，选择对咖啡因分离检测的最优条件。

2.2 方法分析性能研究

在最优试验条件下，计算信噪比为3 时的咖啡因浓度，即为方法检出限（LOD）。通过高效液相色谱法检测重复检测相同咖啡因样品，计算咖啡因峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD，n=7），即为方法重现性。根据咖啡因浓度和峰面积的线性关系绘制拟合标准曲线，得出线性范围、线性方程与线性相关系数R2。对茶水样品进行咖啡因加标回收试验，计算加标回收率，考查方法的准确性。

2.3 茶水样品的制备

根据大众饮茶习惯，称取1 g 干燥的保康茶叶样品（精确至0.001 g），加入50 mL 沸水，浸泡5 min后收集第一道茶水；继续加入50 mL 沸水，浸泡5 min后收集第二道茶水，依次类推收集每次的茶水，并标记对应冲泡次数。取1 mL 茶水，加入20%的甲醇水溶液，定容至10 mL，经0.45 μm 滤膜过滤后用高效液相色谱分离检测。通过工作曲线法计算茶水中的咖啡因含量。

3 结果与分析

3.1 色谱条件的优化

3.1.1 检测波长的选择

在不同检测波长条件下对0.5 mg/L 咖啡因标准溶液进行检测，检测波长分别为270，275，280，286 nm。

检测波长对咖啡因峰面积的影响见表1。

表1 检测波长对咖啡因峰面积的影响

由表1 可知，检测波长为275 nm 时的咖啡因峰面积最大，说明此波长下咖啡因信号响应最强，因此选择275 nm 为最佳检测波长。

3.1.2 流动相的选择

考查流动性中甲醇和0.05%乙酸水溶液的体积比分别为20∶80，25∶85 和30∶70 时的色谱分离效果。

流动相构成对咖啡因保留时间的影响见图1。

图1 流动相构成对咖啡因保留时间的影响

由图1 可知，甲醇和0.05%乙酸水溶液的体积比对咖啡因保留时间及峰形具有明显影响。随着流动相中甲醇比例的增加，咖啡因的保留时间逐渐提前，且峰宽更窄。因此，选择甲醇和0.05%乙酸水溶液的体积比为30∶70 作为流动相。

3.2 方法分析性能评价

3.2.1 方法检出限

将配制好的咖啡因母液分别用超纯水稀释到0.025，0.035，0.050，0.075，0.500 mg/L，在3.1 以优化好的色谱条件下进行检测。最优色谱条件为选择ODS-C18柱(4.6 mm×150.0 mm，5 μm) 为分离色谱柱，甲醇∶水∶乙酸体积比30∶70∶0.05 的混合溶液为流动相，SPD-M20A 紫外检测器，检测波长275 nm，柱温30℃，进样量20 μL。计算不同咖啡因浓度下的仪器信噪比，其中仪器信噪比接近等于3 时的咖啡因浓度即为仪器检出限（LOD），即0.028 mg/L。

3.2.2 方法精密度

配制质量浓度为0.5 mg/L 的咖啡因标准溶液，在最优色谱条件下重复进样7 次，计算峰面积RSD为0.54%。取第一道茶水样品，在最优色谱条件下重复进样7 次，计算峰面积RSD 值为0.28%。

方法精密度考查见表2。

表2 方法精密度考查

表2 结果所示，该方法对咖啡因标准品及实际样品均有很好的检测精密度，重复进样的结果误差小。

3.2.3 咖啡因标准曲线的线性回归

将咖啡因母液分别用超纯水稀释到0.05，0.20，0.50，2.00，5.00，20.00，50.00，100.00，200.00 mg/L，根据咖啡因质量浓度和色谱峰面积绘制拟合标准曲线。

咖啡因标准曲线见图2。

图2 咖啡因标准曲线

由图2 可知，方法线性方程为Y=72 441X-1 122.4，线性范围为0.10～200 mg/L，线性相关系数R2为0.999 2。由此可见，在线性范围内，咖啡因的质量浓度和峰面积具有良好的线性关系。

3.2.4 咖啡因加标回收试验

为考查该方法用于实际样品分析的准确性，对茶水样品进行了加标回收试验。加标质量浓度分别为2.0，5.0，10.0 mg/g。

加标回收试验结果见表3。

表3 加标回收试验结果

由表3 可知，3 个加标质量浓度对应的咖啡因回收率在94.30%～111.50%，可以满足茶水实际样品检测对准确度的要求。

3.3 冲泡过程对咖啡因释放量影响

参考大众日常饮茶习惯，模拟茶叶冲泡过程，通过工作曲线法对每次茶水中的咖啡因含量进行测定。

冲泡过程对茶水中咖啡因含量的影响见表4。

表4 冲泡过程对茶水中咖啡因含量的影响

由表4 可知，每次经沸水浸泡的茶水中均有咖啡因释放，且每次释放量约为上一次的50%，通过计算可知1 g 保康产地绿茶中咖啡因总释放量为36.85 mg。按照成人咖啡因的摄入量等级标准可知，为避免过量摄入咖啡因造成健康危害，成人每天取保康绿茶2.2～6.8 g 泡饮（即成人每天摄入80～250 mg 咖啡因为低摄入量），尽量不超过13.6 g（即咖啡因超过500 mg 为高摄入量）。此外，还可以通过弃去第一道茶水的方式避免咖啡因的过量摄入。

4 结论

建立了高效液相色谱法用于保康绿茶冲泡过程对咖啡因释放量的影响研究。通过优化色谱条件，建立检出限低、重现性好、结果准确的高效液相色谱用于茶水中咖啡因的检测，并对沸水冲泡过程的咖啡因释放量变化进行考查。通过模拟大众饮茶习惯，对每次冲泡的茶水进行检测，结果发现，茶水中咖啡因的释放量逐次减半，基于此可为饮茶方式和饮茶量提出合理健康的建议。