黄师荣，闫 瑞，刘 欢，唐 敏，陈东方

（湘潭大学 化工学院，湖南 湘潭 411105）

榨菜，学名茎瘤芥（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee），是十字花科芸薹属芥菜种中的一种可食用变态茎变种[1]。其叶肉厚多汁，含有丰富的维生素、膳食纤维和矿物质，常被用作橄榄菜和酸菜的原料[2]。据文献报道，榨菜叶含有相当数量的多酚类化合物，不仅具有较强的抗氧化作用，还具有预防和治疗肺癌等功能[3]。由于榨菜叶组织脆嫩、含水量高，采后呼吸作用强，因而不易贮藏。采收后如不及时处理，短时间内就会萎蔫、褪色、腐烂。腌制加工是长期保存蔬菜的方法之一[4]，也是保存芥菜中酚类物质较好的方法[5]。榨菜叶经腌制后，不但可以延长其贮存期，还赋予其独特的风味。所得产物具有解腻开胃、促消化、增食欲的功效。

虽然榨菜叶经腌制后能很好地保留其中的酚类物质，但是这些物质被人体摄食后不一定能被人体完全利用，其在人体内的利用率取决于从食物基质中的释放、在胃肠道消化过程中的稳定性、肠道的吸收[6]等诸多因素。因此，研究消化过程对腌榨菜叶酚类物质含量和抗氧化活性的影响，有助于进一步了解其对人体的有益作用。文献中常用体外模拟胃肠消化来研究食物中各种组分在人体内的消化吸收情况，这种模型使用方便、快捷、使用成本较低而且重现性好。然而，有关体外模拟消化对腌榨菜叶中酚类物质含量和抗氧化活性影响的研究鲜有报道。

另一方面，文献中报道了许多体外消化模型。这些模型所应用的消化条件（如pH 值、消化时间、矿物质类型、离子强度、所用酶的类型和来源等）不尽相同，所得试验结果也不同[7]。然而，目前研究不同的体外消化模型对同一食物中酚类物质含量和抗氧化活性影响的文献较少。为此，选用腌榨菜叶为原料，用6 种不同的体外模拟消化方法进行消化，探究不同消化方法对腌榨叶酚类物质含量和抗氧化活性的影响，有助于探究影响食物中酚类物质生物可及性的因素，也有助于选择研究食物中酚类物质生物可及性的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

腌榨菜（Brassica juncea var.tumida Tsen et Lee）叶，湘潭市新塘湾菜业有限公司提供，将鲜榨菜叶晒蔫后用17%食盐腌制20 d。

氯化钾、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠、三氯化铁（均为分析纯），西陇科学股份有限公司提供；氯化钠、氯化镁、碳酸铵、氯化钙、甲醇、冰醋酸（均为分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司提供；盐酸、无水乙醇、丙酮，湖南汇虹试剂有限公司提供；α-淀粉酶（USP 级，1∶10 000）、胃蛋白酶（USP 级，1∶30 000），上海源叶生物科技有限公司提供；胆汁盐、Trolox，美国Sigma 公司提供；福林酚试剂、ABTS，合肥博美生物科技有限公司提供；芦丁、DPPH、香草醛、胰酶（USP 级，1∶4 000）等，上海麦克林生化科技有限公司提供；TPTZ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供；其余化学试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司提供，实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

500B 型久品多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司产品；101-1AB 型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司产品；Forma-86C 型超低温冰箱，Thermo 公司产品；DL-6M 型大容量冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司产品；THZ-82 型水浴恒温振荡器，金坛市易晨仪器制备有限公司产品；STRIKE 300 型旋转蒸发仪，优莱博技术（北京）有限公司产品；Agilent Cary60 型紫外可见分光光度计，安捷伦科技有限公司产品；FT-200 型高速分散均质机，上海标本模型厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备

将腌制好的榨菜叶晾晒至蔫状后于40 ℃下烘干，粉碎后过60 目筛，装于塑料自封袋中，于通风干燥处避光保存备用。

未消化样品的制备参考Lee M A 等人[8]的方法并稍作改动，取5 g 腌榨菜叶粉与体积分数为70%的乙醇溶液100 mL 充分混合，于37 ℃下水浴振荡2 h，然后以转速6 000 r/min 离心10 min 取上清液，重复提取3 次后合并上清液，用旋转蒸发仪45 ℃，以转速100 r/min 蒸发浓缩后定容至30 mL，于-20 ℃下保存备用。

1.3.2 体外模拟胃肠消化

分别采用李斌等人[9]、姚轶俊等人[10]、曹卓阳等人[11]、Gawlik-Dziki U 等人[12]、Pellegrini M 等人[13]和Minekus M 等人[14]报道的方法并稍作修改，对腌榨菜叶进行体外模拟口腔、胃和肠消化，研究其酚类物质含量及抗氧化活性的变化情况，这些消化方法分别简称为M1、M2、M3、M4、M5 和M6。每种消化方法各消化阶段结束后离心取上清液置于冰浴中10 min终止消化反应，于-20 ℃下保存备用。

不同体外模拟消化方法的主要参数见表1，M6消化方法中模拟唾液、胃液和肠液组成见表2。

表1 不同体外模拟消化方法的主要参数

表2 M6 消化方法中模拟唾液、胃液和肠液组成

1.3.3 总酚含量的测定

参考Majhenic L 等人[15]的方法并稍做改动。取0.5 mL 样品溶液，依次加入2.5 mL 福林酚试剂（用蒸馏水稀释10 倍）和2 mL Na2CO3溶液（75 g/L），混匀后在50 ℃下保温5 min，冷却至室温后于波长760 nm 处测定吸光度。以蒸馏水作空白对照，以没食子酸为标准品，样品总酚含量表示为每克腌榨菜叶中含有没食子酸的当量毫克数（mg GAE/g）。

1.3.4 黄酮含量的测定

参考Cai Shengbao 等人[16]的方法并稍作修改。取1 mL 样品液与体积分数为60%的乙醇溶液4 mL 和5%亚硝酸钠溶液1 mL 充分混匀，室温下保持6 min，加入质量分数为10%的硝酸铝溶液1 mL，摇匀，反应6 min 后加入质量分数为4%氢氧化钠溶液2 mL，振荡混匀后室温放置15 min，于波长510 nm 处测定吸光度。以60%乙醇为空白对照，以芦丁为标准品，样品黄酮含量表示为每克腌榨菜叶中含有芦丁的当量毫克数（mg RE/g）。

1.3.5 花青素含量的测定

参考Corona-Leo L S 等人[17]的方法并稍作修改。取1 mL 样品，分别用氯化钾缓冲液（pH 值1.0）和醋酸钠缓冲液（pH 值4.5）定容至10 mL，在黑暗中静置15 min，分别于波长510 nm 和700 nm 处测定每个样品的吸光度。样品中的花青素含量以相当于矢车菊素-3 -葡萄糖苷含量表示，结果表示为每克腌榨菜叶中含有矢车菊素-3 -葡萄糖苷的当量毫克数（mg C3GE/g）。总花青素含量计算公式如下：

式中：A——吸光度，A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5；

DF——稀释系数（1∶10）；

MW——矢车菊素-3 -葡萄糖苷分子量（449.2 g/mol）；

ε——矢车菊素-3 -葡萄糖苷摩尔消光系数（26 900 L·mol-1·cm-1）；

1——路径长度，cm；

Wt——样品质量，g；

V——样品体积，mL。

1.3.6 单宁含量的测定

参考李春阳等人[18]的方法并稍作修改。首先由1%香草醛溶液和8%盐酸溶液以1∶1（V/V）的比例混合配制显色剂，现配现用。取1 mL 样品溶液，加入5 mL 显色剂后振荡摇匀，在30 ℃恒温水浴中避光保持30 min 后于波长500 nm 处测其吸光度。以蒸馏水作空白对照，以儿茶素为标准品，样品中的单宁含量表示为每克腌榨菜中含有儿茶素的当量毫克数（mg CE/g）。

1.3.7 ABTS 自由基清除能力的测定

参考Garzón G A 等人[19]的方法并稍作修改。将7 mmol/L ABTS 溶液和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液以1∶1（V/V）的比例充分混匀，在室温下避光静置12～16 h 后，用甲醇调节其于波长734 nm 处吸光度为0.700±0.020 制得ABTS 储备工作液。取0.3 mL样品溶液与5.7 mL ABTS 储备工作液振荡摇匀，于室温下避光反应2 h，于波长734 nm 处测定吸光度。将样品清除率换算成Trolox 摩尔浓度，结果表示为每克腌榨菜相当于Trolox 的当量微摩尔数（μmol TE/g）。ABTS 自由基清除率计算公式如下：

式中：A0——空白样品的吸光度；

Ax——测试样品的吸光度。

1.3.8 DPPH 自由基清除能力的测定

参考Liu Q 等人[20]的方法并稍作修改。取3 mL样品溶液，加入0.2 mmol/L DPPH 甲醇溶液3 mL，振荡摇匀，在室温避光反应30 min，于波长517 nm处测定其吸光度。将样品清除率换算成Trolox 摩尔浓度，结果表示为每克腌榨菜相当于Trolox 试剂的当量微摩尔数（μmol TE/g）。DPPH 自由基清除率计算公式如下：

式中：A0——空白样品的吸光度；

Ae——测试样品的吸光度。

1.3.9 铁离子还原能力的测定

参考Thaipong K 等人[21]的方法并稍作修改。将0.3 mol/L 乙酸钠缓冲液（pH 值3.6）、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液以10∶1∶1（V/V/V）的比例混合，配制成FRAP 工作试剂。取1 mL 样品溶液，加入4.5 mL FRAP 工作试剂，充分混匀，在室温黑暗条件下反应30 min，测定其于波长593 nm处的吸光度。将样品铁还原能力换算成Trolox 摩尔浓度，其结果表示为每克腌榨菜相当于Trolox 的当量微摩尔数（μmol TE/g）。铁离子还原能力计算公式：

式中：A1——测试样品的吸光度；

A2——空白样品的吸光度。

1.4 数据统计与分析

每个试验重复2 次，通过Excel 2010、SPSS 19.0 和origin 8.5 等软件进行数据统计分析处理，并将结果以“平均值±标准差”表示，同时采用ANOVA 进行Duncan's 差异分析检验显著性，以p＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同体外模拟消化方法对腌榨菜叶中酚类物质含量的影响

不同体外模拟消化方法对腌榨菜叶总酚、黄酮、花青素和单宁含量的影响见表3。

表3 不同体外模拟消化方法对腌榨菜叶总酚、黄酮、花青素和单宁含量的影响

经口腔消化后，6 种消化方法所得样品的总酚含量较未消化样品均显著降低（p＜0.05，下同），可能是由于在口腔消化阶段腌榨菜叶与消化液接触时间较短，导致其中的酚类物质释放不充分。在经不同方法消化的样品中，M1 样品总酚释放量（约80%）最低，而M2 样品释放量（约93%）最大，M3 和M6 样品与M2 样品的释放量相当。这些差异可能是由于α -淀粉酶的含量及反应时间的不同导致，M2中α -淀粉酶的酶活最大且反应时间最长。在胃消化后，与未消化样品（5.52 mg GAE/g）相比，M1 样品的总酚含量差异不显著（p＞0.05，下同），M6 样品显著增加，其他样品则显著下降；与口腔消化样品相比，M4、M5 和M6 样品的总酚含量显著增加，分别增加了7.4%，8.7%，32.0%；M2 和M3 样品分别损失了8.16%和10.76%的总酚，而M1 样品则无显著差异，推测可能是由于M6 中离子强度较大，促进了酚类物质的释放，而M3 离子强度较小使酚类物质降解或者转发。在肠消化后，M4 样品释放的总酚含量较胃消化样品无显著差异，其他样品则显著增加，可能与M4 中胰酶浓度较低和消化时间较短有关。结果表明，腌榨菜叶经M4 消化后各消化阶段的总酚含量均显著低于未消化样品，可能是由于M4 方法中各消化阶段消化酶含量较低及消化时间较短，导致样品中总酚的不充分释放。与未消化样品相比，经M4肠消化后腌榨菜叶中的总酚含量显著降低，而经其他方法消化的样品总酚含量则显著增加，其中M6 样品的含量最高。文献中也报道了许多不同的食物经不同的方式消化后，其抗氧化物质的变化情况不同。Ng Z X 等人[7]研究发现体外模拟消化降低了大多数功能性植物食品中的总酚和黄酮含量，而其他研究[22-23]则报道了食用植物和蔬菜汁在体外消化后的总酚含量增加。这种相互矛盾的结果据认为可能是由于不同的食物种类、提取溶剂和消化方法产生的。

口腔消化后，M2 样品的黄酮含量与未消化样品无显著差异，其他样品则显著减少，可能是由于M2中α -淀粉酶的酶活较大且反应时间较长，使黄酮类物质更多的释放。在不同方法消化的样品中，M2样品的黄酮含量最高，而M5 的最低，M4 和M5 的差异不显著。在胃消化后，M1 和M2 样品的黄酮含量较未消化样品无显著差异，M6 样品显著增加，而M3、M4 和M5 样品则比未消化样品均显著降低，可能是M3、M4 和M5 胃消化过程中样品的黄酮类化合物高度代谢的缘故。除了M1、M4 和M6 样品黄酮含量较口腔消化样品显著增加外，其他样品则无显著性变化。M6 样品的黄酮含量最高，而M5 的最低。在肠消化后，M1、M2、M3 和M6 样品黄酮含量较未消化和胃消化样品均显著增加，M4 样品则显著降低，M5 样品的黄酮含量较胃消化显著增加，但低于未消化样品。结果表明，不同的消化方法对腌榨菜叶中黄酮类化合物的释放会产生不同的影响，M1、M2、M3 和M6 消化后黄酮含量显著高于M4 和M5，推测可能是由于M4 和M5 口腔消化阶段缺少CaCl2溶液，不利于黄酮类化合物的释放。

经不同的口腔消化后腌榨菜叶的花青素含量变化与总酚含量变化趋势一致，均较未消化样品显著降低。在胃消化后，M2 花青素含量较口腔消化无显著差异，M3 显著下降，其他样品则显著增加，其中M1 的含量最大，M2 和M3 的含量为0。在肠消化后，M1 和M6 花青素含量与未消化相比分别增加至3.55 和1.20 倍，其他样品则显著下降，其中M4 样品的含量最低。M4 花青素含量与胃消化相比也显著降低，其他样品则显著增加。

口腔消化后M2 和M6 的单宁含量与未消化相比差异不显著，其他样品则显著降低，M1 降低最大，降低了43.69%。在胃消化后，M2 和M3 的单宁含量较口腔消化显著降低，其他样品则显著增加；与未消化样品相比，M5 的单宁含量显著增加，M2 和M3显著下降，其他样品差异不显著。在肠消化后，M4样品的单宁含量与未消化样品相比差异不显著，其他样品则显著增加，其中M6 样品增加最大，增加至3.51 倍。M4 在胃和肠消化阶段单宁含量变化与未消化样品（2.22 mg CE/g）均无显著差异，可能是由于其消化酶含量较低，导致消化不完全。

综上可以看出，腌榨菜叶经6 种不同方法体外模拟消化后，M4 的酚类物质含量最低，可能与其肠消化时间（1 h）较短有关；M6 消化后的多酚和单宁含量最高，可能与其离子强度较高有关；而M1 消化后的黄酮和花青素含量最高，可能与其肠胃消化的pH 值较高有关。结果表明，不同的消化方法对食物的酚类物质含量变化影响很大。

2.2 不同体外模拟消化方法对腌榨菜叶抗氧化活性的影响

不同体外模拟消化方法对腌榨菜抗氧化能力的影响见表4。

表4 不同体外模拟消化方法对腌榨菜抗氧化能力的影响

在口腔消化后，不同方法消化的腌榨菜叶的ABTS 自由基清除能力均显著低于未消化样品的，M6样品的清除能力最大，M2 的最小，M4 与M2 的值相当。在胃消化后，M2 和M3 样品的ABTS 自由基清除能力与口腔消化样品相比显著降低，其他样品则显著增加，M6 样品增加最大，增加了28.6%；经胃消化后，M6 样品的ABTS 自由基清除能力与未消化样品的相当，其他样品显著低于未消化样品。肠消化后，除M4 样品比胃消化样品的ABTS 自由基清除能力显著降低外，其他样品的清除能力均显著增加；与未消化相比，M1 和M6 的ABTS 自由基清除能力显著增加，其他样品则显著降低，M6 样品增加最大，增加了3.64 倍，M4 样品下降最大，下降了61.8%。

在口腔消化后，M4 样品的DPPH 自由基清除能力与未消化样品相比无显著差异，M6 样品显著降低，而其他样品则均显著增加；M3 增加最大，增加了59.1%。在胃消化后，M2 和M3 样品比口腔消化样品的DPPH 自由基清除能力显著降低，其他样品则显著增加，M4 样品增加最大，增加了106.3%，其次分别为M6、M5 和M1；经胃消化后，所有消化样品的DPPH 自由基清除能力均显著高于未消化样品。肠消化后，除M4 样品的DPPH 自由基清除能力较胃消化样品显著降低外，其他样品均显著增加，M2 样品增加最大，增加了145.8%，其次分别为M3、M6、M1 和M5；与未消化样品相比，经6 种不同的肠消化方法后样品的DPPH 自由基清除能力均显著增加，M2 增加最大，M3 与M2 无显著差异，M4 增加最小，M5 与M5 无显著差异。

经口腔消化后，所有消化样品的FRAP 均显著低于未消化样品。在胃消化后，M2 和M5 的FRAP与口腔消化相比均无显著差异，M3 显著降低，其他样品则显著增加，M6 增加最大，其次分别为M1 和M4；与未消化样品相比，除M6 样品显著增加外，其他消化样品均显著下降，M2 下降最大。肠消化后，除M4 样品的FRAP 较胃消化样品显著降低外，其他消化样品的FRAP 值均显著增加，M2 样品增加最大，其次分别为M1、M3、M5 和M6 样品。经肠消化后，M5 的FRAP 与未消化相比无显著差异，M1、M2 和M6 的FRAP 显著增加，M3 和M4 则显著降低；M2 增加最大，增加了50.3%，M4 下降最大，下降了31.9%。

结果表明，腌榨菜叶经6 种不同方法体外模拟消化后，M4 的3 种抗氧化活性均最低，这与其酚类物质含量最低相一致；M6 的ABTS 自由基清除能力最强，与其多酚和单宁含量最高相一致；M2 的DPPH 自由基清除能力和FRAP 最强，与其黄酮含量较高相一致。但也有一些消化方法所得的抗氧化活性与其酚类物质含量相关性不高，可能是由于除了酚类物质以外的抗氧化物质造成的，如多糖或者其他具有供氢特性的次生代谢物等[22-23]。

2.3 相关性分析

腌榨菜叶经6 种不同体外模拟方法消化后总酚、黄酮、花青素及单宁含量与其抗氧化活性之间的相关性分析见表5。

由表5 可知，腌榨菜叶经6 种不同体外模拟方法消化后的总酚、黄酮、花青素、单宁含量与ABTS和DPPH 自由基清除活性相关性极显著（p＜0.01），其中M1 样品中的黄酮与ABTS 自由基清除活性相关性最大，相关系数为1.000；M6 样品中的黄酮与FRAP 相关性最小，相关系数为0.808。除M4 样品中的花青素含量与FRAP，以及M6 样品中的总酚、花青素和丹宁含量与FRAP 相关性显著（p＜0.05）外，腌榨菜叶经6 种不同体外模拟方法消化后的总酚、黄酮、花青素、单宁含量与FRAP 相关性均极显著（p＜0.01）。不同体外模拟消化样品的酚类物质含量与抗氧化活性之间的相关性分析结果表明，各消化样品的总酚、黄酮、花青素和单宁含量与其抗氧化活性密切相关，是影响其消化过程中抗氧化活性变化的关键因素。

表5 腌榨菜叶经6 种不同体外模拟方法消化后总酚、黄酮、花青素及单宁含量与其抗氧化活性之间的相关性分析

3 结论

评估了6 种不同体外模拟消化方法对腌榨菜叶的酚类物质含量和抗氧化活性的影响，发现体外模拟消化方法对腌榨菜叶的酚类物质含量和抗氧化活性影响很大。M4 消化后的酚类物质含量和ABTS、DPPH 自由基清除能力和FRAP 均最低；M1 消化后黄酮和花青素含量最高；M2 消化后的DPPH 自由基清除能力和FRAP 最大；M6 消化后的多酚和单宁含量最高，ABTS 自由基清除能力最大。说明不同的消化方法对样品消化后抗氧化活性产生不同的影响，对其产生不同影响的原因尚未可知，需要进一步深入研究探讨。