吴锡芳 ，汪 勇 ，彭丽莎 ，罗 洁 ，王 枫

（1）昆明医科大学第三附属医院头颈外科，云南 昆明 650118;2）昆明医科大学第一附属医院放疗科，云南 昆明 650032）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是常见头颈部恶性肿瘤之一，很容易发生淋巴结转移，目前治疗主要以放疗为主综合治疗。鼻咽癌新生血管在它的发生、发展及远处转移中发挥重要的作用。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表达可促进血管新生，VEGF 高表达的患者治疗后总体生存情况较差，并且更容易发生转移[1-2]。研究发现血管内皮生长因子-C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是促淋巴管生长因子，VEGF-C 在鼻咽癌转移中发挥很大的作用，但目前关于VEGF-C在鼻咽癌辐射敏感性方面报道很少。

本研究以VEGF-C 作为研究问题着眼点，探讨VEGF-C 对鼻咽癌CNE-2 细胞小鼠移植瘤辐射敏感性影响及其机制，以期为鼻咽癌抗VEGFC 治疗联合放疗提供理论支持，也为鼻咽癌患者的治疗提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料

细胞株，CNE-2 细胞来源于上海复旦大学，培养条件：1 640+10%FBS+1%双抗+1%谷氨酰胺完全培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞融合度达到80%时，接种细胞于6 孔板，待细胞长至70%，按组别进行换液，常规传代。

1.2 研究方法

1.2.1 质粒和siRNA 干扰用锐博human VEGFC siRNA 转染套装对CNE-2 细胞进行VEGF-C siRNA 干扰预实验，筛选出干扰效果最好的siRNA 序 列。VEGF-C siRNA 靶序列如下：siRNA-1，5 ′-GGCTTATGCAAGCAAAGATCTG G-3′；siRNA-2，5′-ACCCAGAATATTGGAAAA TGTAC-3′；siRNA-3，5′-CAGAATATTGGAA AATGTACAAG-3′；NC，5′-UUCUCC GAACG UGUCACGUTT-3′。

CNE-2 细胞组换液为1640 基础培养基，siRNA NC 对照组换液为含80 nM NC 的1640 基础培养基；干扰序列换液为含80 nM siRNA 干扰序列的1640 基础培养基；培养48 h 后，收集细胞，提取细胞总RNA，Q-PCR 检测各组细胞VEGFC 的表达情况，通过分析，发现干扰效果最好序列，并采用此序列进行后续实验。

1.2.2 定量RT-PCR（qRT-PCR）按Trizol 法提取细胞总RNA，先进行逆转录反应合成cDNA，以逆转录反应中获得的cDNA 为模板，GAPDH 为内参对照，SYBR™ Green PCR Master Mix 用于qPCR 测定、20 µL PCR 扩增体系。反应条件为：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共进行40 个循环。2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达水平。

1.2.3 免疫印迹分析收到细胞后，将培养板中的培养液吸干净，PBS 洗涤2 次，每孔细胞板，加入300 µL 的RIPA 裂解液（含50 µL 蛋白酶抑制剂），冰盒上裂解5 min，然后用细胞刮刀刮取细胞，将细胞收集到1.5 mL 离心管中，并加入100 µL SDS 蛋白上样缓冲液，水浴93 ℃ 10 min，取出后自然冷却，测定总蛋白浓度。经过SDSPAGE 电泳，转膜（采用湿转法转膜）。免疫反应，将PVDF 膜置于5%的牛血清白蛋白中，室温（20 ℃～30 ℃）封闭1 h；脱色摇床上，TBST 漂洗3 次，每次5 min；尽量吸干BSA 液，加入一抗（VEGFC 蛋白抗体稀释比1∶200，GAPDH 蛋白抗体稀释比1∶3 000）5 mL，装入杂交袋中，将剪好的PVDF 膜置于其中，捆绑于静音混合仪上，放置4 ℃冰箱中过夜；取出杂交袋，室温复温10 min，去除一抗液体，加入TBST 缓冲液洗膜3 次，每次10 min；加入酶标二抗（兔二抗 1∶3 000，鼠二抗 1∶3 000），室温孵育2 h。TBST 洗膜3 次，每次10 min。ECL 显色：用吸水纸尽量吸干PVDF 膜上的水分后，将其平放在采集化学发光信号凝胶成像仪里；吸取ECL 试剂盒中的A 液和B 液各50 µL 加入900 µL 双蒸水中，混匀，均匀地滴加到膜上；点击live aquire，开始采集图像。

1.2.4 细胞增殖实验用CCK-8 溶液测定细胞存活率。收集各组细胞培养上清于96 孔板，另按试剂盒说明书设置空白孔、对照孔、阴性组，每组3 孔重复；向每孔加入10 µL 的CCK-8 溶液；培养箱中孵育24 h，酶标仪（美国MD 公司）450 nm波长处测定吸光度。

1.2.5 实验动物与照射通过昆明医科大学动物所购买周龄均为6 周左右的SPF 级BALB/C 小鼠用SPF 级饲料条件饲养，经过1 周时间待小鼠情况稳定后，对小鼠进行成瘤实验（合格证号：1107271911003162）。

照射条件：Synergy VAMT，放射源为6MV X-射线，细胞单次受照射剂量为2 Gy 源皮距100 cm 照射，剂量率为300 cGy/min。

1.2.6 动物实验设计向小鼠腋下皮下注射鼻咽癌细胞CNE-2，每日观察瘤体生长情况，待瘤体体积达到0.7 cm3左右，将小鼠随机分为6 组，每组6 只：模型瘤体组为瘤体内注射50 µL 生理盐水连续注射4 d，然后每3 d 补注射1 次；siRNANC 组，每天注射浓度为50 nM 的siRNA-NC 50 µL，连续注射4 d，然后每3 d 补注射1 次；siRNAVEGF-C 组，每天注射浓度为50 nM siVEGF-C 50 µL，连续注射4 d，然后每3 d 补注射1 次；照射组为瘤体内注射50 µL 生理盐水连续注射4 d，然后每3 d 补注射1 次，同时每日进行2 Gy X 射线照射，连续照射4 d；siRNA-NC+照射组为瘤体内注射siRNA-NC，连续注射4 d，瘤体每日照射2 Gy，连续照射4 d，然后每3 d 补注射1 次；照射组+siRNA-VEGF-C，瘤体内注射50 nM si-VEGF-C 50 µL，连续注射4 d，瘤体每日照射2 Gy，连续照射4 d，然后每3 d 补注射1 次。照射后继续饲养小鼠15 d，每天观察肿瘤生长情况，同时用游标卡尺对肿瘤体积测量1 次，V=a2×b/2（a 为瘤体长径、b 为瘤体短径）。15 d 后处死小鼠进行瘤体取材，比较肿瘤大小。

1.2.7 小鼠移植瘤组织免疫组化实验（1）石蜡切片制备 将固定好的组织放入包埋盒中，用乙醇进行脱水处理，二甲苯透明，将透明好的组织块置入在石蜡内，让石蜡易于渗入。将过滤好的新蜡倾入包埋器中，尽快将浸透蜡的组织块放到里面。用石蜡切片机将石蜡块切成4 µm 厚的切片。进行贴片，将完毕的石蜡切片在60 ℃烤箱烘烤过夜。

（2）免疫组化染色 切片进行常规脱蜡、水化，用PBS 漂洗，抗原修复，3%过氧化氢封闭，在用PBS 漂洗，用滤纸将切片周围的水分吸干，用5%羊血清封闭，加合适浓度的第一抗体，反复用PBST 漂洗，滴加PV9000 试剂Ⅰ、Ⅱ，每张组织切片上滴加DAB 显色液，室温避光孵育5 min，蒸馏水冲洗，终止显色，苏木素复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察显色结果并拍照。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.O 统计软件进行分析，数据以均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析（one way ANOVA），2 组间比较采用t检验。P＜ 0.05 表示差异有统计学意义；应用ImageJ 软件做蛋白电泳条带灰度分析。

2 结果

2.1 稳定的沉默VEGF-C 表达鼻咽癌细胞系CNE-2 的建立

将VEGF-C 特异性siRNA 序列（siVEGF-C-1、siVEGF-C-2 和siVEGF-C-3）分别转染到CNE-2细胞中。采用CCK-8 法、qRT-PCR 法和免疫印迹法检测不同siRNA 对CNE-2 细胞增殖及VEGFC mRNA 和蛋白表达的影响。如图1 所示，干扰CNE-2 细胞的VEGF-C 后，在0、12、24、36 h后，测定细胞增殖，发现细胞增殖逐渐下降，其中siVEGF-C-1 组细胞增殖下降最明显，见图A。采用qRT-PCR 法检测mRNA 的表达，3 组序列中，siVEGF-C-1 组mRNA 表达量最低，siVEGFC-1 组VEGF-C mRNA 与正常组和阴性对照组比较明显降低（P＜ 0.01），见图B。siRNA-1 序列转染CNE-2 细胞48 h 后，通过免疫印迹法检测VEGF-C 的蛋白表达，如图C 和D 所示，与正常组和阴性对照组（NC）相比，VEGF-C 蛋白表达显著降低（P＜ 0.01）。结果表明，采用VEGF-C siRNA 转染试剂盒（RBbio）第1 组序列，进行干扰CNE-2 细胞VEGF-C 能降低VEGF-C mRNA和蛋白表达，成功干扰鼻咽癌细胞CNE-2 中VEGF-C 表达。

图1 鼻咽癌细胞CNE-2 中VEGF-C 干扰序列筛选Fig. 1 The establishment of VEGF-C silenced NPC cell lines

2.2 动物实验检测干扰VEGF-C 对小鼠移植瘤辐射敏感性影响

对小鼠腋下皮下注射鼻咽癌细胞CNE-2，每日观察瘤体生长情况，待瘤体直径达到0.7 cm3左右，将小鼠随机分为6 组，每组6 只。每3 d 观察肿瘤大小，15 d 后处死小鼠进行瘤体取材。收集数据绘制肿瘤生长折线图，结果如图2 所示，si-VEGFC 组肿瘤体积小于si-NC 阴性对照组和瘤体组；si-VEGFC+照射组肿瘤体积小于单独照射组。结果说明：干扰VEGF-C 使肿瘤生长速度减慢，干扰VEGF-C 可增加辐射敏感性。

图2 动物实验检测干扰VEGF-C 对肿瘤大小影响Fig. 2 Animal experiment to detect the influence of interfering VEGF-C on tumor size n=6。

2.3 采用免疫组化检测干扰VEGF-C 对小鼠VEGF-C、p-65、ATM 影响

剥离小鼠的肿瘤，4%多聚甲醛固定、包埋、切片，进行免疫组化染色，检测VEGF-C、ATM、p65 蛋白表达变化。如图3 所示免疫组化结果表明：在干扰组中，VEGF-C 蛋白表达明显少于瘤体组和阴性对照组（P＜ 0.05），照射组与瘤体组相比VEGF-C 增加（P＜ 0.05）；与照射组相比，干扰组+照射组中VEGF-C 蛋白表达降低（P＜ 0.05），这表明：干扰组成功降低VEGF-C 表达，同时也说明辐射可刺激VEGF-C 表达升高。图4 所示p65 蛋白表达，与瘤体组相比，p65 蛋白表达在干扰组中增加（P＜ 0.05）；但与照射组相比，干扰组+照射组p65 变化不明显，细胞实验表明干扰VEGF-C 可增加p65 表达。图5 表示ATM 蛋白表达变化，与瘤体组和阴性组相比，干扰VEGF-C后ATM 表达减少（P＜ 0.05）；与照射组和阴性对照组+照射组相比，照射组+干扰组中ATM 减少（P＜ 0.05）。免疫组化结果表明：干扰鼻咽癌细胞CNE-2 中VEGF-C，使p65NF-κB 升 高，NFκB 通路下游ATM 降低。

图3 免疫组化检测VEGF-C 表达（×400）Fig. 3 Immunohistochemical detection of VEGF-C expression（×400）

图4 免疫组化检测p65 表达（×400）Fig. 4 Immunohistochemical detection of p65 expression（×400）

图5 免疫组化检测ATM 表达（×400）Fig. 5 Immunohistochemical detection of ATM expression（×400）

3 讨论

目前研究表明鼻咽癌中VEGF 表达率可达60%～80%左右，通过Meta-analysis 分析发现：组织和血清中血管内皮生长因子水平的测定具有重要意义，可预测鼻咽癌预后[3]。鼻咽癌患者淋巴结转移机率比较高，首诊患者以颈部肿块为主要症状的多达40%～50%左右。VEGF 亚型的VEGF-C 是较早发现能特异性促进淋巴管新生的生长因子[4]。黄方等[5]研究发现在鼻咽癌组织中高表达的VEGF-C、NF-κB p65 及Survivin 与鼻咽癌的临床分期及颈淋巴结转移密切相关，通过检测VEGF-C、NF-κB p65 及Survivin 表达水平，可预判鼻咽癌恶性程度及转移具有一定的意义。研究发现肿瘤细胞可通过自分泌和旁分泌形式释放VEGF-C，与表达淋巴内皮细胞的血管内皮生长因子3 受体特异性结合，进而刺激下游信号通路ERKl/2 和P13K/AKT 信号通路，诱导新生淋巴管和加速肿瘤细胞往区域淋巴结转移[6-7]。

为发现VEGF-C 更多潜在的功能，本研究使用RNA 干预技术，实时定量PCR 检测结果表明：VEGF-C 的mRNA 表达水平在siVEGF-C 组均显著下调；Western Blot 检测VEGF-C 的蛋白质表达水平，结果表明在siVEGF-C 组显著下调。证明成功干扰鼻咽癌细胞 CNE-2 中VEGF-C 基因，可用此技术研究VEGF-C 与放射敏感性的关系。

小鼠移植瘤实验结果证明，干扰VEGF-C 后，接种了鼻咽癌CNE-2 细胞小鼠生长速度减慢，对于照射组，干扰+照射组肿瘤明显变小。15 d 后处死小鼠，通过免疫组化发现，与照射组相比，干扰+照射组，VEGF-C、ATM 减少，与瘤体组相比，干扰组p-65 增加，VEGF-C、ATM 减少。动物实验结果表明：根据肿瘤生长曲线和免疫组化结果发现，干扰鼻咽癌细胞CNE-2 中VEGF-C通过NF-κB 信号通路增加辐射敏感性。这与细胞学实验结果相一致：在鼻咽癌CNE-2 细胞干扰VEGF-C 后，通过NF-κB 信号通路引起ATM减少引起细胞DNA 损伤修复减少，进而提高放疗敏感性[8]。

Gorski 等[9]研究证实：Lewis 肺癌细胞体外接受电离辐射后，VEGF 的表达明显增高。这提示电离辐射诱导肿瘤细胞VEGF 高表达，可能是肿瘤治疗过程中产生抵抗性有关。有研究证实VEGFR2 在肿瘤细胞内表达高低与其对放射线抗拒密切相关，阻断肿瘤细胞内VEGFR2 能提高肿瘤细胞放射敏感性[10]。刘亮等[11]研究发现内皮抑素能增强VEGFR2 高表达肺癌细胞放射敏感性，其机制可能是内皮抑素降低VEGFR2 表达后，通过PI3K/AKT 和MAPK/ERK 2 条非乏氧途径下调HIF-1a 表达，进而增强肺癌细胞放射敏感性。动物实验也表明：抑制鼻咽癌CNE-2 小鼠VEGFC 表达后，明显增加辐射敏感性。

放疗引起的DNA 损伤可激活NF-κB，调节靶基因的转录与表达[12]。NF-κB 可以同时存在促进转录和抑制转录的作用，转录因子究竟发挥促进还是抑制作用，与其结合的调控因子有关，而究竟哪些调控因子会一起结合上去，则与刺激因素有关[13-14]。NF-κB 作为一种转录因子，可与ATM 发生特异性的结合，进而调控细胞的DNA 损伤。Jung 等[15]研究表明：ATM 能够激活NF-κB，并影响辐射敏感性，他们数据表明，ATM 功能降低通过激活NF-κB，促进放疗敏感性。ATM 作为P53 上游基因，P53 蛋白有2 个丝氨酸位点被ATM 磷酸化后活性上调来调控DNA修复，当损伤不能被完全修复，P53 介导细胞发生凋亡。本研究发现DNA 损伤修复基因ATM，在siVEGF-C+照射组中，免疫组化表明ATM 表达下降，导致了细胞DNA 修复受损，进而使DNA 损伤加重，增加放疗敏感性。

综上所述，在移植鼻咽癌CNE-2 细胞小鼠中，干扰VEGF-C 后可明显提高放疗疗效，其机制主要通过激活NF-κB 信号通路进而降低ATM 表达，使DNA 损伤修复能力下降。本研究结果为鼻咽癌的抗血管治疗提供实验依据，随着研究不断深入，相信越来越多证据将会证实辐射联合抗血管治疗可提高放疗疗效。