蒋玉娥 ，钟兆铭 ，高艳章 ，王 伟 ，孙瑞梅 ，孙传政

（1）昆明医科大学第三附属医院/云南省肿瘤医院检验科;2）头颈外二科，昆明 云南 650118;3）昆明医科大学第一附属医院肿瘤内科，昆明 云南 650032）

甲状腺未分化癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）高度恶性，发病率占全部甲状腺癌的1%～3%，但其致死率却占全部甲状腺癌的35%～50%，研究发现ATC 高死亡率与确诊时近50%的远处转移发生率关系密切[1-2]，因此，探究ATC 高侵袭转移的机制，为ATC 的靶向治疗提供更多新方案尤为关键。早在19 世纪临床专家就发现，肿瘤患者血小板（platelet，PLT）增多与肿瘤转移有关[3-4]。最近一项包含17 285 例患者、中位随访超过5 a 的临床研究发现，每日服用阿司匹林（抗PLT 聚集药物）的患者其肿瘤远处转移发生率显著降低[5]；笔者前期临床回顾性研究也发现，一些ATC 患者外周血血小板计数增多与其更差的预后密切相关[1]，本研究拟利用人ATC 细胞为研究对象，探索PLT 促进ATC 细胞迁移及侵袭能力的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株实验所用ATC 细胞系（ARO、FRO、SW579）来自美国模式培养物集存库（ATCC），昆明医科大学第三附属医院肿瘤研究所有冻存品备用。所有细胞系均在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养，ARO 和FRO 细胞系在含5%胎牛血清（FBS）的1640 培养基中培养，SW579 在含10% FBS 的DMEM 培养基中培养。

1.1.2 主要试剂及来源抗体（fibronectin、snail、a-catenin、GAPDH）购于Cell signal technology，Ecadherin 抗体购于 Abcam 公司，细胞因 子TGFβ1 购于Peprotech 公司。PCR 引物购于生工生物，PCR 的mix 购于Invitrogen 公司。使用的qPCR 设备来自罗氏公司。

1.2 实验方法

1.2.1 PLT 提取抽取健康志愿者外周静脉血5 mL 于抗凝管中（包括ACD 液），静置30 min，室温200 g 离心20 min，上清液即为富含PLT 的血浆。吸出上清置于EP 管中，室温800 g 离心20 min，弃上清管底沉淀为PLT。轻轻沿管壁加入PLT 洗涤液1 mL，重复1 次。Tyrode 缓冲液（包括5 mM 葡萄糖和新鲜3% BSA）重悬PLT。提取的PLT 尽快用于实验以防其失活。将PLT 与ATC 细胞按照10∶1 的比例加入无血清培养基中进行共培养。

1.2.2 划痕实验单细胞层、低血清（1%胎牛血清）体系培养。一次性10 µL Tip 头尖端在培养皿中划3～5 道平行线，于0、6、12、24 h 随机取5 个不同视野观察划痕愈合并照相。

1.2.3 Transwell 迁移实验将8 µm 孔径的小室放入24 孔板中，ATC 细胞加入上层腔室（无血清培养基），下层为含10%胎牛血清培养基。10 h后取出培养小室，PBS 洗涤小室预冷甲醇固定细胞20 min 后，小心用棉签擦拭去除室内贴附细胞，0.5%结晶紫室温染色5 min 计数。

1.2.4 酶联免疫吸附实验（ELISA）首先包被抗体4 ℃孵育过夜，然后加入100 µL 待测细胞培养上清进行孵育，室温2 h。随后加入TGFβ1 检测抗体进行孵育，室温2 h。紧接着加入100 µL辣根过氧化物酶（HRP）标记溶液进行孵育，室温避光20 min。再加入100 µL 底物液进行孵育，室温避光20 min，孵育结束后加入50 µL 终止液。将孔板放入酶标仪中，波长设置为450 nm 和570 nm，测定完毕后保存光密度值（OD 值）。纵坐标为OD 值，横坐标为浓度进行作图，计算相应样品的浓度。

1.2.5 实时定量荧光聚合酶链反应（Real-time PCR）用TRIZOL 法抽提ATC 细胞总RNA，逆转录合成为cDNA，设计合成磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）及TGFβ1 引物，△Ct 法计算目的基因表达差异。Real-time PCR 体系（共10 µL）组成：1 µL cDNA、1 µL 2.5 µmol 上下游引物、3 µL ddH2O、5 µL SYBR qPCR SuperMix。引物序 列：GAPDH Sense 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCA GC-3′，Anti-sense 5′-CCCAATACGACCAAA TCCGTT-3′；TGFβ1 Sense 5′-GGCCAGATCCT GTCCAAGC-3′，Anti-sense 5′-GTGGGTTTCC ACCATTAGCAC-3′配置完毕后即可上机，按说明书步骤设置程序：95 ℃预变性5 min 95 ℃变性15 s；60 ℃退火与延伸 30 s；95 ℃ 15 s；60 ℃1 min；95 ℃ 3 min.结果判定：目的基因的相对表达量（relative expression）=2-△Ct。△Ct=目的基因Ct 值的均数-内参基因的Ct 值。

1.2.6 蛋白质免疫印迹杂交（Western blot）首先提取总蛋白，用BCA 蛋白质测定法检测蛋白质浓度。随后配置9%的 SDS-PAGE 凝胶，将蛋白样品按照每孔30 µg 进行上样，电泳完毕后进行转膜，用250 mA 电流于冰上转膜2.5 h。用5%脱脂牛奶进行封闭，室温1 h，封闭完成后1×TBST 洗3 次，每次洗5 min，然后孵育一抗[fibronectin（1∶1 000）、snail（1∶1 000）、a-catenin（1∶2 000）、GAPDH（1∶4 000）、E-cadherin（1∶1 000）]，4 ℃过夜，一抗孵育完毕后用1×TBST洗3 次，每次洗10 min，然后孵育二抗，室温1 h，二抗孵育完毕后用1×TBST 洗3 次，每次洗10 min。最后，用化学发光底物试剂盒（ECL）进行发光成像。Image J 软件进行灰度分析。

1.3 统计学处理

SPSS 19.0 软件包统计分析实验数据。均值比较采用t检验，P＜ 0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PLT 诱导ATC 细胞发生EMT

为了研究PLT 对ATC 细胞形态变化及功能的影响，用从健康人外周静脉血提取的PLT 与ATC细胞（FRO、SW579）共培养48 h，加入10 倍数量的PLT 后，在显微镜下观察ATC 细胞的形态，结果发现ATC 细胞发生了EMT 样变化，见图1A。进一步通过Western Blot 实验检测EMT 相关蛋白的表达，发现PLT 可诱导ATC 细胞表达更多的间叶标记蛋白（fibronectin 和snail），证实PLT 可诱导ATC 细胞发生EMT。

图1 PLT 诱导ATC 细胞发生EMTFig. 1 Platelets induce epithelial mesenchymal transition in ATC cells

2.2 与ATC 细胞共培养促进PLT 分泌TGFβ1

将PLT 与ATC 细 胞（ARO、FRO 或SW579）共培养36 h，Real-time PCR 检测共培养液中TGFβ1 mRNA 未见显著增高（ARO 细胞甚至降低）（P＜ 0.01），而Elisa 检测发 现共培 养液中TGFβ1 蛋白水平显著升高（P＜ 0.001）（FRO 细胞最显著），提示TGFβ1 蛋白可能主要来源于PLT释放，而非PLT 合成，见图2。

图2 PLT 与ATC 细胞共培养后TGFβ1 的表达情况Fig. 2 Expression of TGFβ1 after co-culture PLT and ATC cells

2.3 TGFβ1 促进ATC 细胞的迁移能力

为探索TGFβ1 对ATC 细胞的影响，将SW579 细胞与PLT 共培养8 h，或在ATC 细胞中直接加入rhTGFβ1（1 ng/mL）8 h 后，Transwell 迁移实验显示，PLT 或rhTGFβ1 可使穿过小室的ATC 细胞显 著增加（P＜ 0.001），提 示PLT 或rhTGFβ1 能显著增强SW579 细胞的迁移能力（P＜ 0.001），见图3A。同样，划痕实验也证实rhTGFβ1 可显著增强SW579 细胞的迁移能力（P＜ 0.01），见图3B。

图3 rhTGFβ1 促进SW579 细胞迁移能力增强Fig. 3 rhTGFβ1 promotes the migratory ability of SW579 cells

2.4 PLT 通过TGFβ1 促进ATC 细胞发生EMT

用PLT 或rhTGFβ1 处理SW579 细胞发现，间叶标记物fibronectin 增高而上皮标记物αcatenin 下降，见图4A，提示PLT 可能通过分泌TGFβ1 促进ATC 细胞发生EMT；为了检测PLT是否分泌其他常见细胞因子促进EMT 发生，用CSF1、IL-11 和TGFβ1 分别处理ARO 细胞发现，只有TGFβ1 诱导间叶标记物fibronectin 上调和上皮标记物E-cadherin 下调，见图4B，提示PLT 可能通过释放TGFβ1 诱导ATC 细胞发生EMT 最终促进其迁移能力。

图4 PLT 通过TGF β1 促进ATC 细胞发生EMTFig. 4 Platelets promote epithelial-mesenchymal transition in ATC cells through TGFβ1

3 讨论

ATC 恶性程度极高，近年来，尽管手术设备和技巧不断提高，放疗设备、方案不断创新，化疗联用方案、靶向治疗及免疫治疗不断推陈出新，但ATC 确诊后中位生存期一直在3～9 个月，1 a生存率不足20%；其高度恶性和极差的预后与其高侵袭转移能力密切相关[1-2]。另一方面，恶性肿瘤患者常出现特鲁索综合征，即肿瘤患者血栓形成增多和血液呈高凝的状态[6]。历史和最近的研究不断表明，PLT 增多与神经系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤以及妇科肿瘤患者更差的预后密切相关[3,4,6-8]。笔者在前期临床研究也发现，ATC 患者外周血PLT 增多与临床更差的预后相关[1]，提示PLT 可能会促进ATC 细胞的转移潜力，然而其机制远不清楚。

在其他的实体肿瘤中研究发现，PLT 可通过多种机制促进肿瘤的侵袭与转移。比如，肿瘤细胞进入外周血后可诱导PLT 聚集并包裹肿瘤细胞，使循环肿瘤细胞免受NK 细胞和TNFα 诱导的细胞死亡；进一步的分子水平研究发现，肿瘤细胞可通过粘附分子p-选择素、GPIIb-IIIa（αIIbβ3整合素）以及C 型凝集素样受体（CLEC）-2 与肿瘤细胞来源的Podoplanin（平足蛋白）相互作用活化PLT，导致PLT 颗粒释放高浓度细胞因子，如ATP、PDGF、TGFβ1，协助肿瘤细胞粘附和外渗，最终促进肿瘤转移[3,7,9-12]；类似研究也证实，阻断TGFβ1 或其受体显著降低乳腺癌肺转移[13-15]，提示TGFβ1 可能与PLT 促进恶性肿瘤进展密切相关。为探索TGFβ1 是否在PLT 促进ATC 恶性进展中发挥作用，采用PLT 与ATC 细胞共培 养36 h，Real-time PCR 检 测TGFβ1 mRNA 未见显著增高，而Elisa 检测TGFβ1 蛋白水平显著升高，同时还发现TGFβ1、PLT 显著增强ATC 的迁移能力（图2、图3），因此笔者推测PLT 可能通过释放TGFβ1 最终促进ATC 的迁移和侵袭能力。

用PLT 处理ATC 细胞后采用Western blot 实验测定EMT 相关标记物发现，间叶标记物（fibronectin、snail）增高，提示PLT 可能诱导ATC细胞EMT 发生；同样采用TGFβ1 刺激SW579细胞发现，上皮标记物α-catenin 表达下降而间叶标记物fibronectin 增高。为检测PLT 是否也通过其常分泌的细胞因子促进ATC 细胞发生EMT，用CSF1、IL-11 处理ARO 细胞发现，二者均不能诱导上皮标记物E-cadherin 下调和间叶标记物fibronectin 上调，同时ATC 细胞经与PLT 共培养48 h 后，ATC 细胞形态朝间叶组织方向转化。所以，笔者认为ATC 细胞通过刺激PLT 释放TGFβ1，后者诱导ATC 细胞发生EMT 进而促进其侵袭和迁移能力。

综上所述，本研究提示，PLT 活化后可通过分泌TGFβ1 促进ATC 细胞发生EMT 进而促进ATC 细胞侵袭和迁移能力，提示TGFβ1 可能成为ATC 患者靶向治疗的潜在靶点，但上述研究结果仍需要包括体内实验在内的进一步证实。