谭小兵 ，张 敏 ，郭 宇 ，杜琳玲 ，戴青原

（1）云南省第一人民医院口腔医学中心/昆明理工大学附属医院，云南 昆明 650032;2）昆明医科大学第一附属医院心内科，云南 昆明 650032）

自从诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）产生以来，它在细胞移植治疗、药物筛选和人类疾病模型等方面的应用前景就受到广泛关注[1-3]。iPSCs 的应用正逐渐走向临床研究，探索用于各种疾病的细胞治疗，如帕金森、黄斑变性、脊髓损伤等[4]。制约其进一步应用的一大瓶颈就是较低的重编程效率[5]，而微小RNA（microRNAs，miRNAs）在体细胞重编程中的调控作用逐渐受到重视[6]。牙源性细胞易于获取、重编程效率高，采用仙台病毒诱导可得到安全性能较高的iPSCs，是理想的种子细胞[7]。前期研究[8]分析人牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）重编程过程miRNAs 的表达谱，结果发现miR-130b-3p 明显上调，提示它可能通过调控iPSCs 核心基因在重编程中发挥作用。为明确miR-130b-3p 对人DPSCs 重编程的作用，本研究拟用miR-130b-3p 转染DPSCs，再用仙台病毒体系进行诱导，提出如下假说：miR-130b-3p 可以促进DPSCs 的重编程，为进一步探索miR-130b-3p 的作用机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 实验仪器和材料

α-MEM 培养基、胎牛血清、Vitronectin、TriZol 试剂盒、iPS 2.0Sendai reprogramming kit 购自美国Invitrogen；Lipofectamine 3000 试剂购自美国ThermoFisher；PSCeasyII 人多潜能干细胞培养基、PSCeasy 人多潜能干细胞消化液、Repro-Easy 重编程培养基购自北京赛贝生物；一步法RT-PCR 试剂盒购自天根生化科技（北京）；hsamiR-130b-3p-mimics 质粒由上海吉玛制药技术有限公司合成；倒置相差显微镜购自德国Carl Zeiss。

本研究方案得到云南省第一人民医院医学伦理委员会的批准同意实施（2018LH051）。

1.2 实验方法

1.2.1 人DPSCs 复苏培养复苏冻存的DPSCs（第3 代），完全培养液：αMEM+10%胎牛血清 +1% L-谷氨酰胺+1%青/链霉素，37 ℃、5%二氧化碳恒温孵育箱内培养。

1.2.2 miR-130b-3p 转 染（1）miR-130b-3pmimics 质粒的构建：设计合成LV3-shRNA DNA模板，退火处理，取10 µg LV3 载体进行酶切处理，构建LV3-shRNA 载体、氯化钙法制备感受态细胞、转化连接产物、抽取质粒、EcoRI 进行单酶切鉴定，阳性克隆进行测序鉴定，测序正确的菌株进行抽提，所得质粒用于后续实验；（2）has-miR-130b-3p-mimics 转染DPSCs：取1 mL DPSCs（浓度1×105/mL）铺于6 孔培养板，30-50%融合时将7.5 µL Lipofectamine 3000 试剂加入250 µL MEM，同时将2.5 µg 质粒（分组：miR-130b-3p 空载组和过表达组）和10 µL P3000 试剂加入250 µL MEM，各取上述预混液125 µL 混匀，室温孵育15 min，然后加入细胞，12 h 后换成正常完全培养基，48 h 后显现较强荧光时收集细胞，RT-qPCR 进行验证；（3）RT-qPCR 检测基因表达：RT-qPCR 对照组 为 DPSCs+miR-130b-3p-NC，实验组为DPSCs+miR-130b-3p-mimics。转染48 h后加入Trizol 提取总RNA，逆转录试剂盒逆转录成cDNA，设计合 成hsa-miR-130b-3p 引 物（CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU），qPCR 检 测基因的表达，实验结果用2^-△△CT法进行分析，U6 作为内 参（F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACGCTTCACGAATTTGCGT）。

1.2.3 2 组DPSCs 的重编程实验组为miR-130b-3p 转染DPSCs，对照组为正常DPSCs，严格按照重编程试剂盒说明书进行操作，简述如下：转染前2 d 将2 组细胞铺在6 孔板内（1×105/孔）培养，当天（第0 天）培养基内加入70 µL SeV，隔天再加入130 µL 新鲜培养基，第2 天将培养基换为DPSCs 培养基，第3 天将转染细胞转移到Vitronectin 覆盖培养板，加入Repro-easy 培养基，每日换液。克隆出现且大小合适时，将克隆分割为小块，PSC-easy 培养基（加10 mM Y27632）继续培养。80%左右融合时，人多潜能干细胞消化液进行传代，人多潜能干细胞培养基持续培养，每日换液。

1.2.4 2 种DPSCs-iPSCs 的鉴定（1）形态学观察：2 组iPSCs 克隆形态对比。（2）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）：TriZol 试剂盒提取2 种iPSCs 总RNA，一步法RT-PCR 试剂盒检测基因的表达。简述如下：细胞80%融合时，加入适量TriZol 提取细胞总RNA，配制50 µL 反应体系，引物序列，见表1。反应条件：42 ℃ 30 min（逆转录）、95 ℃ 3 min（预变性）、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s（40 次循环，扩增）、72 ℃ 5 min（补充延伸），反应产物1%琼脂糖凝胶电泳，染色成像。

表1 RT-PCR 特异性引物的序列Tab.1 Specific primer sequences of RT-PCR

1.2.5 重编程效率比较比较2 组iPSCs 的重编程效率，计算公式：iPSCs 克隆数/转染细胞数×100%。

1.3 统计学处理

GraphPad Prism 软件（8.0）分析数据和制图，计数资料2 组间比较采用卡方检验，计量资料2组间比较采用t检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-130b-3p 转染DPSCs

miR-130b-3p 转染48h 后可见目标细胞内明显的荧光染色，见图1A、图1B，实验组miR-130b-3p 的表达水平显著高于对照组（P＜ 0.01），见图1C。

图1 miR-130b-3p-mimics 转染DPSCs 效率验证Fig. 1 Validation of DPSCs transfection efficiency by miR-130b-3p-mimics

2.2 2 种iPSCs 形态和标记物表达

2 组iPSCs 均表现为特征性致密的圆形克隆，边缘清晰、集落内部细胞圆形、形态均一、核质比较大，RT-PCR 结果证实所2 组iPSCs 均可表达干细胞特异标志物Oct4、Nanog，同时外源性病毒SeV 或转录因子KOS/Klf4/c-Myc 不再表达，见图2。

图2 2 组iPSCs 克隆形态和特异性标记物的表达Fig. 2 Morphology and specific markers expression of iPSCs in two groups

2.3 重编程效率

2 组DPSCs 转染前约为1×105个细胞，重编程后正常组获得约18 个ES 样克隆（效率=0.018%），对照组获得约37 个克隆（效率=0.037%），高于正常组（检验水准α=0.05，P＜0.05）。

3 讨论

早期研究发现，miR-130b-3p 通过直接抑制干扰素调节因子1 影响M1 巨噬细胞的极化[9]，也可直接抑制色域解旋酶DNA 结合蛋白9 影响结肠直肠癌细胞的增殖，从而促进肿瘤的发生和进展[10]，但其在体细胞重编程过程中的作用机制尚未报道。本研究所用Lipofectamine 3000 转染试剂采用脂质纳米颗粒技术，尤其是对难以转染的干细胞可以实现超高的转染效率，笔者的研究结果也证实这一点。前期生信分析结果提示miR-130b-3p 可能对DPSCs 的重编程有调控作用。为验证这一假说，笔者首先在人DPSCs 内过表达miR-130b-3p，再用仙台病毒进行重编程成功得到miR-130b-3p-DPSCs-iPSCs，其克隆形态、特异性干细胞基因表达和外源性基因沉默等特性与正常DPSCs-iPSCs 相同，且具有更高的重编程效率，但克隆的生长速度较为缓慢。Sendai virus 重编程系统是一种RNA 非整合重编程技术，不会结合到宿主细胞染色体或破坏宿主基因，采用单克隆挑选和无饲养层培养技术得到的iPSCs 生物应用的安全性得到提高，本研究结果与Ye[11]和Okumura 等[12]结果一致。

多项研究已发现miRNAs 在体细胞重编程的重要调控作用。Lin 等[13]研究发现miR-302 可以替代传统转录因子OSKM，将人和小鼠体细胞重编程为iPSCs。miR-302 作为基因沉默，同时可下调多个关键的表观调节蛋白，诱导产生全基因组脱甲基化。miR-302 结合AOF2/1 和MECP1/2的基因转录产物，形成RNA 诱导、带有阿尔古蛋白和Dicer 核糖核酸内切酶的沉默复合体以抑制这些关键调节蛋白的转录。Lin 等[14]进一步研究发现miR-302 靶向沉默AOF2 以破坏DNMT1 活性，抑制iPSCs 复制相关DNA 甲基化，发生被动性去甲基化。从某种意义上说，重编程发生的机制就是全基因组的去甲基化[15]。miR-302 诱发重编程事件的机制可能为：一是抑制4 个表观调节蛋白KDM1、AOF1、p66/MECP1 和MECP2 的表达；二是作用于TGF-β II 型受体，阻断TGFβ 信号通路，加速间充质-上皮转化过程；三是靶向结合BMP 抑制剂TOB2、DAZAP2、SLAIN1，从而激活BMP 信号通路，促进iPSCs 的产生。

其他研究也证实miRNAs 对体细胞重编程的重要调控作用。Miyoshi 等[16]联合应用miR-200c、miR-302、miR-369（无OSKM 因子），成功将大鼠和人细胞重编程为iPSCs。其他研究也发现更多的与重编程和iPSCs 多能性相关的miRNAs 及其靶基因的相互作用，包括miR-290 簇、miR-let7家族、miR-130/301/721 家族、miR-106b-25/miR-106a-363、miR-181 家族等[17]。最新研究发现miR-27b 可以抑制未分化hiPSCs 的多能性标记物碱性磷酸酶和Nanog 同源异构体的表达和细胞增殖，而过表达miR-27b 可下调BMP 诱导的中胚层标记物，表明miR-27 可以抑制iPSCs 的早期分化[18]。另一项研究通过生物信息学分析、双荧光素酶报告和基因敲除实验证实miR-34c 通过靶向c-Myc 可以影响iPSCs 细胞的增殖和多能性[19]。

综上所述，本研究首次发现miR-130b-3p 过表达可以促进人DPSCs-iPSCs 的生成，同时保持iPSCs 的生物学特性，为人们进一步了解miRNAs调控体细胞重编程的作用机制及干细胞治疗提供研究基础。深入比较2 组iPSCs 在多向分化潜能、核型分析、核心蛋白表达、表观遗传特性等方面的差异，同时研究miR-130b-3p 促进人DPSCs重编程生成的作用机制将是笔者下一步的研究内容。