董培良，刘柯萌，曹庆宇，陈元金，许天恩，韩 华

（1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150000；2.黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150000）

阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）是发病率最高的中枢神经系统退变性疾病。研究表明五味子中的木脂素类成分可增加AD大鼠体内神经生长因子（nerve growth factor,NGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）、胶质细胞源性神经营养因子（glialcell-derived neurotrophic factor,GDNF）的含量[1]，提高SOD和GSH-Px活性[2-3]，减少AD大鼠神经细胞损伤。此外，五味子多糖还可抑制TNF-α、IL-1β等炎症因子的释放，降低AD大鼠的炎症水平[4]。中药可通过多靶点、多途径改善AD[5-6]，其机制与抗氧化、抗炎有关[7-8]。

目前对五味子的研究主要集中在其果实。然而，有证据[9]表明五味子藤茎的化学组分与五味子果实具有很高的相似性。但在自然培植和野生林木护养过程中大量的藤茎被修剪除掉，造成了极大的药用植物资源浪费[10]。为此，课题组前期以五味子醇甲（SolA）、五味子醇乙（SolB）、五味子酯甲（SthA）、五味子甲素（SinA）、五味子乙素（SinB）和五味子丙素（SinC），6种木脂素的含量作为评价指标，采用高效液相色谱（HPLC）法作为分析方法，对五味子藤茎中木脂素的提取纯化工艺进行了优化，提高其有效成分的含量，并作为原料药来进行后续五藤片的成型工艺研究。但所制得的干浸膏粉吸湿性较强，不方便保存，且直接口服顺从性较差，故有必要对其成型工艺进行优化。因此，本试验采用单因素考察结合Box-Benhnken响应面法对五藤片的辅料种类及用量进行了成型工艺研究，为五藤片的开发奠定实验基础。

1 材 料

1.1 仪器Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；KQ3200DE型数控超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司）；XPR26DR型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；FW80型高速万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；YP-1400型单冲压片机（上海顺仪实验设备公司）；BJ-1型崩解时限测定仪（郑州南北实验仪器公司）；CS-2A型片剂脆碎度测定仪（天津天河分析仪器公司）。

1.2 试药与试剂北五味子藤茎于黑龙江省饶河县采收且经黑龙江中医药大学药学院药用植物教研室樊锐锋副教授鉴定为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.的藤茎；五味子醇甲对照品（批号：7432-28-2，纯度：＞98%）、五味子醇乙对照品（批号：58546-54-6，纯度：＞98%）、五味子酯甲对照品（批号：58546-56-8，纯度：＞98%）、五味子甲素对照品（批号：61281-38-7，纯度：＞98%）、五味子乙素对照品（批号：61281-37-6，纯度：＞98%）、五味子丙素对照品（批号：61301-33-5，纯度：＞98%）均购自成都埃法生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱级，购自天津大茂化学试剂厂；纯净水购自杭州娃哈哈公司；乳糖（批号：20160829）购自国药集团化学试剂有限公司；淀粉（批号：20190220）购自河南千志商贸有限公司；糊精（批号：20181101）购自潍坊盛泰药业有限公司；微晶纤维素（批号：20190404）购自安徽友泰生物工程有限公司；硬脂酸镁（批号：20181102）购自河北鸿道生物工程有限公司；低取代羟丙纤维素（批号：F20180329）购自国药集团化学试剂有限公司；交联聚维酮（批号：P181001083）购自博爱新开源医疗科技集团股份有限公司；羧甲基淀粉钠（批号：20181107）购自湖州菱湖新望化学有限公司；羧甲基纤维素钠（批号：20190308）购自河南千志商贸有限公司。

2 方法与结果

2.1 总木脂素的含量测定

2.1.1 色谱条件Agilent TC-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱，洗脱程序为0～10 min，40%A～50%A；10～20 min，50%A～55%A；20～30 min，55%A～70%A；30～40min，70%A～80%A。体积流量为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为250 nm，进样量为10 μL。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.1.2 混合对照品溶液制备 取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素对照品适量于同一容量瓶中，加入甲醇后超声溶解，制成含五味子醇甲（203.6 μg/mL）、五味子醇乙（194.1 μg/mL）、五味子酯甲（204.5 μg/mL）、五味子甲素（197.2 μg/mL）、五味子乙素（206.7 μg/mL）、五味子丙素（202.4 μg/mL）的混合对照品溶液，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 称取一定比例药材，根据预试验得到的最佳提取工艺进行8倍量95%乙醇提取2次，每次1 h，提取液稀释一定浓度，备用。

通过HPLC法，以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的含量之和作为总木脂素的含量为研究指标，3次重复试验测得其提取物中的总木脂素含量分别为22.45、21.86、22.73 mg/g，平均提取率为22.35 mg/g。符合试验要求的标准，以便后续进行五藤片的成型工艺研究。

2.2 干浸膏粉的制备按照前期确定的提取纯化工艺，利用回流提取法将五味子藤茎干燥粉末用8倍量95%乙醇进行提取，提取2次，每次提取1 h。再利用AB-8型大孔吸附树脂和95%乙醇进行纯化，将洗脱液浓缩，得到五味子藤茎乙醇浸膏，干燥粉碎即得干浸膏粉。

2.3 单因素考察

2.3.1 填充剂的筛选

2.3.1.1 填充剂种类的筛选 由于中药提取物具有较强的吸湿性和黏性[11]，根据制备片剂工艺的要求，可选用不同种类和用量的吸湿性较低、流动性和稳定性较好的辅料，来改善中药提取物易吸湿、流动性差的缺点。以制成颗粒的制粒难度、流动性和溶解性为考察指标，对填充剂种类进行了处方筛选。结果显示，处方1和4采用乳糖和微晶纤维素作填充剂时，颗粒的制粒难度较易，流动性和溶解性都较好，考虑到微晶纤维素的成本高于乳糖，因此选用乳糖进行下一步研究。（见表1）根据文献报道[12]，微晶纤维素不仅可以作为填充剂，还可以作为崩解剂提高崩解时间，并且可改善单独使用乳糖制粒所造成的黏筛网、颗粒过硬的问题，所以在乳糖中加入适量的微晶纤维素，确定乳糖与微晶纤维素的比例为5:1。

表1 填充剂的筛选结果

2.3.1.2 填充剂用量的筛选 填充剂用量不同，其制粒效果也会不同。通过对不同原辅料比例颗粒的制粒难度、流动性和溶解性进行考察。结果显示颗粒的制粒难度、流动性和溶解性在不同比例填充剂的影响下差别不大。结合实际情况与试验结果确定填充剂与干膏粉的比例为1∶1。（见表2）

表2 填充剂用量的筛选结果

2.3.2 黏合剂的筛选 黏合剂的选择对于软材的制备及制粒效果有较大的影响。以制粒难度、颗粒外观作为考察指标，分别考察加入50%乙醇、65%乙醇、80%乙醇、95%乙醇后对制粒效果的影响，筛选出最优黏合剂。结果显示选择50%的乙醇作为黏合剂时，制粒物料黏结成块，不可制粒；选择95%的乙醇作为黏合剂时，制粒物料黏性过小，易过筛，不适合制粒。综合考虑选择65%乙醇溶液作为黏合剂的效果最好。（见表3）

表3 黏合剂的筛选结果

2.3.3 崩解剂的筛选 使用原料药、乳糖、微晶纤维素制粒，分别加入不同的崩解剂，并以片剂表面性状、崩解时限和片剂完整状况为指标，分别考察加入低取代羟丙纤维素（L-HPC）、交联聚维酮（PVPP）、羧甲基淀粉钠（CMS-Na）和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）后各指标情况。结果显示综合片剂表面性状、崩解时限及片剂完整状况，使用PVPP的片剂表面光洁、完整，崩解时间最少，故选用PVPP作为崩解剂。结果显示综合片剂表面性状、崩解时限及片剂完整状况3个指标，使用PVPP的片剂表面光洁、完整，崩解时间最少，故选用PVPP作为崩解剂。（见表4）

表4 崩解剂的筛选结果

2.3.4 润滑剂的筛选

2.3.4.1 润滑剂种类的筛选 压片前在颗粒中加入适宜的润滑剂，可以减少对冲头的磨损，减少黏冲，提高药物颗粒的流动性，并使片剂表面光滑、整洁。硬脂酸镁有良好的润滑作用，包裹性强，与药物颗粒混匀后不易分离[13]。本试验以休止角为指标，考察加入0.5%硬脂酸镁和滑石粉2种润滑剂对颗粒的润滑效果。结果显示硬脂酸镁的休止角为33.9°，滑石粉的休止角为36.3°。与滑石粉比较，加入0.5%硬脂酸镁后的药物颗粒有着较好的流动性，可更好地提高颗粒的润滑效果，故选择硬脂酸镁作为润滑剂。

2.3.4.2 润滑剂用量的筛选 使用原料药、乳糖、微晶纤维素制粒，分别加入不同比例的硬脂酸镁作为润滑剂，测定休止角考察最佳润滑剂用量，结果显示颗粒的流动性随着硬脂酸镁加入比例的提升而提升。当硬脂酸镁加入比例为0.8%、1.0%、1.2%时，其流动性的性能基本相当，考虑到硬脂酸镁会影响到片剂的崩解，故选择加入硬脂酸镁的比例为0.8%。（见表5）。

表5 硬脂酸镁添加比例对颗粒流动性的影响

2.4 Box-Benhnken响应面法优化五藤片的成型工艺

2.4.1 试验设计及结果 在单因素考察的基础上，将填充剂用量（A）、崩解剂用量（B）、润滑剂用量（C）3个因素设为自变量，以崩解时限、片重差异、脆碎度作为综合评价指标，将结果进行加权相加后得出总分。考察各因素对成型工艺的影响，每个因素选取低、中、高3个水平，试验设计因素水平见表6，试验结果见表7。

表6 Box-Benhnken响应面法因素水平表

表7 Box-Benhnken响应面法试验设计及结果

续表7：

2.4.2 模型分析 采用Design expert 12软件对以上结果进行方差分析，得回归方程：Y=85.00+1.25A+2.13B-4.28C+0.25AB-0.25AC+0.5BC-3.25A2-7.00B2-9.50C2，模型的相关系数r=0.942 1。方差分析结果见表8，P＜0.000 1，F=214.02，表明该回归方程模型差异性显著。修正相关系数为0.991 7，说明该模型能解释99.17%响应值的变化，表明该模型与实际试验拟合程度良好，可以对五藤片的成型工艺进行分析和预测。由表8可知，对五藤片的成型工艺影响因素大小为润滑剂用量（C）＞崩解剂用量（B）＞填充剂用量（A）。一次项A、B、C和二次项A2、B2、C2影响极其显著（P＜0.01），其余影响不显著（P＞0.05）。

表8 方差分析

续表8：

2.4.3 响应面优化结果 根据拟合结果，利用Design expert 12统计软件绘制响应面图和等高线图，见图2。结合响应面模型分析，确定最优成型工艺为填充剂用量62.06%、崩解剂用量为2.15%、润滑剂用量为0.89%。结合实际操作的可行性，选择填充剂用量62%、崩解剂用量为2%、润滑剂用量为0.8%。

图2 各因素交互的响应面图和等高线图

2.5 验证试验按照优化得出的条件称取干膏粉、乳糖、微晶纤维素混匀，加入适量的65%乙醇制粒，在50℃下干燥，整粒。加入0.8%的硬脂酸镁混匀，压片。按照此工艺制备3批片剂，结果得到的片剂综合评分为84分，与预测值85.8分非常接近，说明该响应面的模型和所得工艺条件是可行的。片剂整洁光滑，重量差异、崩解时限、脆碎度和硬度均符合2020年版《中华人民共和国药典》规定。（见表9）

表9 验证试验结果

3 讨 论

目前关于五味子的现代研究多围绕果实展开，而有关藤茎的研究并不多见[14]。本试验以五味子藤茎提取物为主药，采用单因素考察及Box-Benhnken响应面法[15-16]对各辅料种类及用量等因素进行筛选并优化，确定五藤片的最优成型工艺为62%的乳糖与微晶纤维素作为填充剂与干膏粉1∶1混合，65%的乙醇作黏合剂，2%的交联聚维酮作为崩解剂，0.8%的硬脂酸镁作为润滑剂。开发了一条工艺稳定且适合工业化生产的五藤片成型工艺路径。

在五藤片的成型工艺研究中，由于其原料药为五味子藤茎的醇提物浸膏，其干膏粉黏性较强，流动性差，所以需要加入适量的润滑剂以方便其制粒[17]。在选择填充剂用量的时候，为了减少实际治疗时的患者服药量，提高药物治疗的依从性，在保证制得片剂的标准合格的前提下，尽量少加或不加填充剂[18]。五味子藤茎醇提物干膏粉有很强的吸湿性，易黏结成块，预试验对湿法制粒压片与全粉末直接压片[19]两种方法进行了筛选，结果表明全粉末直接压片压出的片剂外观、硬度不符合要求，所以选择湿法制粒压片法。据文献报道，微晶纤维素不仅可以提高片剂的崩解时限，还可以提高片剂压片的硬度[20]，所以在乳糖中加入一部分微晶纤维素来提高片剂的质量。

本试验对于五藤片的成型工艺进行了考察，优化后所制得片剂外观、崩解时间、片重差异、脆碎度、硬度等指标均符合2020年版《中华人民共和国药典》规定。选用五味子藤茎入药部位可丰富药用植物资源，减少药植资源的浪费，具有良好的应用前景。但缺少对其有效成分的溶出度考察。在以后的研究中应加入定量分析评价指标，更加全面地对成型工艺进行评价，以考察本研究所制备五藤片在成型工艺中的优势。