刘东波，李 卫，何藻鹏，郑 韬，陈远芬，霍启灿，何欣桥

（广州医科大学附属顺德医院/佛山市顺德区乐从医院，广东 佛山 528315）

糖尿病作为常见的代谢类疾病，近年来在我国发病率逐渐上升，引起人们广泛关注。糖尿病可引发机体多种器官功能障碍，导致糖尿病患者出现多种并发症[1-2]。糖尿病引起的伤口愈合缓慢作为典型的伴随症状，危害患者的皮肤组织，严重时会引发慢性皮肤溃疡。据研究统计，糖尿病患者同时患有慢性皮肤溃疡的概率较高，且难以根治。目前，针对相关疾病治疗的药物逐渐增多，但大多成本较高，用于预防和缓解糖尿病皮肤缺损的药物还有待进一步开发[3-4]。糖尿病的调控受多条通路影响，3-磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）通路在缓解糖尿病脑血管损伤过程中发挥重要作用，且被证实可通过调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）的表达参与促进血管新生。而血管新生是皮肤缺损愈合过程中的关键环节，对创面形成过程中炎症反应消除、组织细胞增殖具有重要影响[5-7]。

黄芪甲苷是黄芪的主要活性成分之一，具有增强免疫力、降血糖、促进血管新生等多种功效，已被证实参与修复受损血管并参与血管再生，加速伤口愈合[8-9]。研究[10]还发现，黄芪甲苷可参与调节PI3K/AKT/eNOS通路，调节内皮细胞生长，改善血管舒张。但黄芪甲苷是否通过调节PI3K/AKT/eNOS通路介导修复糖尿病引起的皮肤损伤，有待实验进一步证实。本研究通过构建糖尿病大鼠皮肤损伤模型，探究黄芪甲苷对糖尿病大鼠皮肤缺损创面愈合的影响。

1 材料与方法

1.2 药物与试剂黄芪甲苷（批号：RS00161020）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；链脲佐菌素（批号：S110910）、PI3K抑制剂LY294002（批号：HY-10108）均购自aladdin公司；护理软膏（备案号：浙杭械备20190111号）购自杭州金花医药生物科技有限公司；苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色试剂盒（批号：60524ES60）购自翌圣生物科技有限公司；Masson染色试剂盒（批号：BP-DL021）购自南京森贝伽生物科技有限公司；Microfil血管造影剂（批号：MV-122）购自苏州蚂蚁淘生物科技有限公司；GAPDH抗体（批号：ab9485）、PI3K抗体（批号：ab133595）、p-PI3K抗体（批号：ab207484）、AKT抗体（批号：ab38449）、p-AKT抗体（批号：ab133458）、eNOS抗体（批号：ab199956）、p-eNOS抗体（批号：ab230158）、VEGF抗体（批号：ab150375）、VEGFR2抗体（批号：ab233693）均购自abcam公司；羊抗兔二抗（批号：A9169）购自德国默克公司。

1.3 主要仪器KL-B2型包埋机（湖北康龙电子科技有限责任公司）；TD5B型离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；7500定量PCR仪（ABI公司）；580/590微量血糖仪（江苏鱼跃医疗设备股份有限公司）；SCANCO 100型microCT扫描仪（杭州越波生物科技有限公司）；CA-268型凝胶成像系统（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.4 造模与分组36只SD大鼠按随机数字表法分为糖尿病组、皮肤损伤组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、护理软膏组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组，各组大鼠均持续喂食高糖高脂类食物，持续喂养2周后，麻醉大鼠，腹腔内注射链脲佐菌素50 mg/kg。依据参考文献方法[11]判定糖尿病大鼠造模结果：注射后3～5 d之间，每天随机选取2个时间点对鼠尾静脉采血。微量血糖仪检测血糖值，若检测血糖值均＞16.7 mmol/L即为造模成功。结果实验用大鼠均造模成功。

1.5 实验给药麻醉各组大鼠，背部采用脱毛膏脱毛后清水洗净并消毒，皮肤损伤组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、护理软膏组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠沿背部中线切除1.5 cm×1.5 cm圆形皮肤组织，伤口消毒后立刻用无菌纱布包扎，每日表面消毒并更换纱布一次，记录大鼠创面愈合情况，黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠表面消毒后，在更换纱布前于大鼠伤口处均匀涂抹黄芪甲苷溶液（100 mg/mL，使用生理盐水稀释）1 mL，黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠腹腔内注射PI3K抑制剂，10 mg/kg；黄芪甲苷低剂量组于大鼠伤口均匀涂抹黄芪甲苷溶液（20 mg/mL，使用生理盐水稀释）1 mL；护理软膏组于大鼠伤口均匀涂抹护理软膏2 g；糖尿病组、皮肤损伤组不做处理。1次/d，持续用药21 d。

1.6 观察指标

1.6.1 大鼠创面愈合率检测 依据参考文献方法[12]裁剪1.5 cm×1.5 cm圆形半透明纸张模仿受损伤皮肤，称质量记作半透明纸总质量。分别于大鼠术后7、14、21 d的用药间隙，在半透明纸上描绘各组大鼠背部伤口处创面形成图形，剪下称取描绘图形质量记作背部创面图形质量，依据公式计算创面愈合率。公式如下：

创面愈合率（%）=（半透明纸总质量-背部创面图形质量）/半透明纸总质量×100%。

1.6.2 大鼠创面组织新生血管检测 持续用药21 d后，各组大鼠按0.1 mL/10 g剂量注射4%水合氯醛麻醉处理，固定于操作台上，沿胸腔剪开暴露心脏，左心室处插入静脉留置针，切开右心耳，生理盐水灌注直至流出液体清澈。按照Microfil血管造影剂说明书方法配置工作液后灌注。结扎上腔动静脉后4℃过夜，microCT扫描仪扫描显影，构建三维图像，比较各组血管化面积比。

研究小组确定了利用课余时间开展英语演讲兴趣小组活动的形式，制定了学期内每两周一次，每次2学时的活动计划。参加活动的学生被分为5个小组，分别由5名教师指导。活动初期，教师通过给学生播放大学生英语演讲比赛光盘的方式，向学生介绍英语演讲的程序和礼仪。活动中期，学生在教师的指导下完成命题演讲、即兴演讲和问答三个板块的训练，并在训练过程中总结英语演讲的方法和技巧。活动后期，针对演讲比赛的全过程进行系统化练习，邀请在英语演讲比赛中成绩优秀的同学与小组成员进行交流并传授经验，鼓励小组成员积极参加各级各类英语演讲比赛。截止2014年1月，研究小组完成了英语演讲第二课堂活动的指导工作。

1.6.3 大鼠创面组织病理学变化观察 持续用药21 d后，采用颈椎脱臼法处死各组大鼠，将各组大鼠创面组织完整切下，糖尿病组大鼠切下背部相同部位用于对照，内面朝上拍摄血管新生图像，用以判断黄芪甲苷对糖尿病大鼠受损皮肤血管生成的影响。将创面组织剪成两部分，部分液氮处理后研磨至粉，冻存备用。部分放入4%多聚甲醛中固定，常规脱水包埋后制作石蜡切片，分别进行HE染色及Masson染色。

HE染色：脱蜡至水，酒精梯度脱水，二甲苯透明，苏木精染色3 min，清水洗净后盐酸酒精分化。2%伊红染色5 min，清水洗净。酒精梯度脱水，二甲苯透明，树胶封片后上镜观察。

Masson染色：脱蜡至水，按照Masson染色试剂盒说明书方法染色后上镜观察。

1.6.4 大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA表达水平 取出冻存备用的创面组织粉末少许，Trizol法提取RNA，按照反转录试剂盒说明书方法反转至cDNA，上机检测PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA的表达水平。mRNA引物序列由文献中获取，广州吉赛生物公司参与合成。引物序列见表1。

表1 引物序列信息

1.6.5 大鼠创面组织PI3K、AKT、eNOS、p-PI3K、p-AKT、p-eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表达水平 取出冻存备用的创面组织粉末少许，加入0.5 mL细胞裂解液，充分裂解细胞，提取蛋白后与上样缓冲液混合均匀，加热8 min，倒入凝胶孔道，电泳跑胶后转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗（GAPDH抗体、PI3K抗体、AKT抗体、eNOS抗体、p-PI3K抗体、p-AKT抗体、p-eNOS抗体、VEGF抗体、VEGFR2抗体，1∶1 500），4℃孵育过夜。TBST清洗3次，3 min/次。加入二抗（1∶1 000），常温孵育45 min，TBST清洗3次，3 min/次。倒入发光液充分浸泡1 min，取出吸去多余水分，置于Syngene光密度扫描系统上，检测条带灰度。

1.7 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用SNK-q检验，创面愈合率的比较采用双因素重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠皮肤缺损后不同时间创面愈合率比较术后不同时间（7、14、21 d）之间所有大鼠创面愈合率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在时间效应，5组均如此。皮肤损伤组、护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面愈合率逐渐升高，且术后21 d愈合率最高（P＜0.05）。5组大鼠创面愈合率总体比较，差异有统计学意义（P＜0.05），即存在分组效应。与皮肤损伤组比较，护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠术后7、14、21 d创面愈合率均明显升高（P＜0.05）；与黄芪甲苷高剂量组比较，黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠术后7、14、21 d创面愈合率均明显降低（P＜0.05）；黄芪甲苷高剂量组大鼠术后7、14、21 d创面愈合率与护理软膏组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。时间因素和分组因素存在交互效应。（见表2、图1）

表2 各组大鼠皮肤缺损后不同时间创面愈合率比较（±s，%）

表2 各组大鼠皮肤缺损后不同时间创面愈合率比较（±s，%）

注：F时间主效应=1190.250，P时间主效应=0.000；F分组主效应=115.426，P分组主效应=0.000；F交互效应=7.046，P交互效应=0.000；与皮肤损伤组比较，aP＜0.05；与黄芪甲苷高剂量组比较，bP＜0.05；与7 d比较，cP＜0.05；与14 d比较，dP＜0.05

给药剂量护理软膏（g）黄芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制剂（mg/kg）皮肤损伤组 6 - - - 7.78±2.36 20.25±3.25 48.23±3.95 243.386 0.000护理软膏组 6 2 - - 21.25±3.72a 46.21±4.84a c 77.62±4.51a c d 249.314 0.000黄芪甲苷高剂量组 6 - 100 - 20.52±3.83a 48.67±4.51a c 79.81±4.26a c d 297.842 0.000黄芪甲苷低剂量组 6 - 20 - 13.36±2.26a b 30.34±3.74a bc 57.72±3.72a bc d 273.805 0.000黄芪甲苷+PI3K抑制剂组 6 - 100 10 14.31±2.32a b 32.83±4.26a bc 60.51±4.15a bc d 238.779 0.000 F 20.841 48.085 64.539 P 0.000 0.000 0.000组别 动物数（只） 7 d 14 d 21 d F P

图1 各组大鼠皮肤缺损后不同时间创面愈合率交互效应轮廓图

2.2 各组大鼠创面组织新生血管情况糖尿病组大鼠创面组织内清晰可见多条血管，血管与血管间脉络清晰；皮肤损伤组大鼠创面组织无明显血管，依稀可见少量脉络，创面组织血管化面积比明显低于糖尿病组（P＜0.05）；护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织出现多条血管，脉络较为清晰，且护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组最为明显，其创面组织血管化面积比均明显高于皮肤损伤组（P＜0.05）；与黄芪甲苷高剂量组比较，黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织血管数量减少，无明显分布，创面血管化面积比均明显降低（P＜0.05）；黄芪甲苷高剂量组大鼠皮肤组织血管数量及创面血管化面积比与护理软膏组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图2、表3）

表3 各组大鼠皮肤缺损后创面血管化面积比比较（±s）

表3 各组大鼠皮肤缺损后创面血管化面积比比较（±s）

注：与糖尿病组比较，aP＜0.05；与皮肤损伤组比较，bP＜0.05；与黄芪甲苷高剂量组比较，cP＜0.05

给药剂量护理软膏（g）黄芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制剂（mg/kg）糖尿病组 6 - - - 49.25±2.36皮肤损伤组 6 - - - 7.46±4.25a护理软膏组 6 2 - - 35.26±4.29a b黄芪甲苷高剂量组 6 - 100 - 33.85±4.37a b黄芪甲苷低剂量组 6 - 20 - 17.82±3.98a b c黄芪甲苷+PI3K抑制剂组6 - 100 10 19.27±4.72a b c F 82.814 P 0.000组别 动物数（只） 创面血管化面积比（%）

图2 各组大鼠创面组织血管直视图及Micro-CT扫描血管图（比例尺：1 mm，×10）

2.3 各组大鼠创面组织病理变化情况糖尿病组大鼠具有正常的皮肤组织，上皮细胞排列紧密，真皮内纤维完好无损，无炎症反应，皮肤内胶原数量多，且排列整齐无间隙；皮肤损伤组大鼠上皮组织破损严重，厚度增加，真皮内纤维间充斥大量炎症细胞，胶原松散，方向不一；护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组大鼠上皮细胞数量逐渐增多，排列较为密集，真皮内纤维间炎症细胞大量减少，胶原数量增多，方向较为规律；黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠上皮组织恢复较慢，仍有少量炎症细胞存在，胶原数量逐渐增多，但仍有少量间隙。（见图3）

图3 各组大鼠创面组织HE染色及Masson染色图（×400）

2.4 各组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA表达水平比较皮肤损伤组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA相对表达量均明显高于糖尿病组（P＜0.05）；护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA相对表达量均明显高于皮肤损伤组（P＜0.05）；黄芪甲苷低剂量组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA相对表达量均明显低于黄芪甲苷高剂量组（P＜0.05）；黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA相对表达量与护理软膏组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA相对表达量比较（±s）

表4 各组大鼠创面组织PI3K mRNA、AKT mRNA、eNOS mRNA、VEGFmRNA、VEGFR2 mRNA相对表达量比较（±s）

注：与糖尿病组比较，aP＜0.05；与皮肤损伤组比较，bP＜0.05；与黄芪甲苷高剂量组比较，cP＜0.05

给药剂量护理软膏（g）黄芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制剂（mg/kg）糖尿病组 6 - - - 1.08±0.12 1.11±0.14 1.06±0.07 1.03±0.07 1.12±0.08皮肤损伤组 6 - - - 1.48±0.25a 1.67±0.21a 1.84±0.31a 2.48±0.31a 1.62±0.21a护理软膏组 6 2 - - 3.36±0.26ab 4.25±0.36ab 3.92±0.34ab 5.37±0.41ab 3.96±0.46ab黄芪甲苷高剂量组 6 - 100 - 3.27±0.32ab 3.97±0.42ab 4.07±0.32ab 5.52±0.38ab 4.12±0.44ab黄芪甲苷低剂量组 6 - 20 - 2.46±0.42abc 2.72±0.33abc 2.47±0.33abc 3.64±0.37abc 2.36±0.28abc黄芪甲苷+PI3K抑制剂组6 - 100 10 3.21±0.27ab 4.21±0.37ab 3.87±0.28ab 5.44±0.29ab 3.92±0.31ab F 70.980 109.797 115.584 198.318 99.806 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别 动物数（只） PI3K mRNA AKT mRNA eNOS mRNA VEGF mRNA VEGFR2 mRNA

2.5 各组大鼠创面组织PI3K、AKT、eNOS、p-PI3K、p-AKT、p-eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表达比较 皮肤损伤组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均明显高于糖尿病组（P＜0.05）；护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均明显高于皮肤损伤组（P＜0.05）；黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS均明显低于黄芪甲苷高剂量组（P＜0.05）；黄芪甲苷高剂量组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋 白 相 对 表 达 量 及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS与护理软膏组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图4、表5）

表5 各组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS比较（±s）

表5 各组大鼠创面组织VEGF、VEGFR2蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS比较（±s）

注：与糖尿病组比较，aP＜0.05；与皮肤损伤组比较，bP＜0.05；与黄芪甲苷高剂量组比较，cP＜0.05

给药剂量护理软膏（g）黄芪甲苷（mg/mL）PI3K抑制剂（mg/kg）糖尿病组 6 - - - 0.43±0.11 0.56±0.21 0.52±0.12 0.42±0.07 0.34±0.13皮肤损伤组 6 - - - 1.12±0.14a 0.95±0.17a 0.86±0.11a 0.77±0.15a 0.63±0.15a护理软膏组 6 2 - - 2.56±0.21a b 2.45±0.26a b 1.56±0.14a b 1.54±0.16a b 1.46±0.11a b黄芪甲苷高剂量组 6 - 100 - 2.47±0.34a b 2.42±0.31a b 1.61±0.14a b 1.49±0.15a b 1.43±0.12a b黄芪甲苷低剂量组 6 - 20 - 1.62±0.23a b c 1.57±0.34a b c 1.22±0.13a b c 1.09±0.14a b c 0.92±0.13a b c黄芪甲苷+PI3K抑制剂组 6 - 100 10 1.74±0.27a b c 1.53±0.27a b c 1.17±0.12a b c 1.14±0.19a b c 1.01±0.11a b c F 74.418 49.147 64.261 50.211 73.453 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000组别 动物数（只） VEGF/GAPDH VEGFR2/GAPDH p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT p-eNOS/eNOS

图4 各组大鼠创面组织PI3K、AKT、eNOS、p-PI3K、p-AKT、

p-eNOS、VEGF、VEGFR2蛋白表达Western blotting图

3 讨 论

糖尿病可引起身体机能丧失，引发多个器官功能衰竭，阻碍血管新生，导致糖尿病患者的伤口愈合能力减弱，引发严重溃疡。研究估测15%～25%的糖尿病患者因此残疾或死亡，故开发促进糖尿病患者受损皮肤创面愈合的药物成为当前研究的热点[13-14]。有文献[15]指出，中医药在治疗皮肤损伤的研究中被证实有良好的效果。黄芪甲苷可以有效促进血管再生，且对于糖尿病引起的肾脏、胰脏等器官的损伤具有良好的治疗效果，推测其对于糖尿病皮肤缺损具有一定的功效。本研究通过手术造成糖尿病大鼠皮肤损伤，依据参考文献[16]，记录不同时间段大鼠创面愈合率的变化情况判断大鼠伤口愈合能力，通过Microfil灌注联用microCT扫描判断大鼠血管新生能力，选用治疗皮肤损伤的常规药物护理软膏作为阳性对照[17]。本研究发现，皮肤损伤后涂抹护理软膏和不同剂量的黄芪甲苷均可以明显提高各时间段的创面愈合率和创面血管化面积比，且护理软膏与高剂量的黄芪甲苷效果最为明显，说明黄芪甲苷可有效加速糖尿病大鼠的伤口愈合，促进血管新生，高剂量的黄芪甲苷具有与常规药物等同的治疗效果。

为进一步观察受损皮肤内在的组织病理学变化，本研究依据文献常用方法，对创面组织进行HE染色及Masson染色[18]。结果发现涂抹护理软膏和不同剂量的黄芪甲苷后创面组织内上皮细胞及胶原数量逐渐增多，炎症细胞减少，且护理软膏与高剂量的黄芪甲苷效果最为明显，进一步验证了黄芪甲苷可参与缓解皮肤炎症，加速皮肤愈合，对于伤口的治疗有良好的效果，但具体的作用机理仍有待进一步探索。

有研究[19-20]指出，PI3K/AKT/eNOS信号通路参与调控VEGF、VEGFR表达及血管再生，且对于糖尿病大鼠脑血管损伤具有良好的治疗效果，推测PI3K/AKT/eNOS信号通路在创面愈合中同样发挥重要作用。本研究发现，皮肤损伤后PI3K/AKT/eNOS通路相关基因mRNA表达、蛋白磷酸化水平及VEGF、VEGFR2蛋白表达明显升高，而涂抹护理软膏和不同剂量的黄芪甲苷后，PI3K/AKT/eNOS通路相关基因mRNA、蛋白磷酸化水平及VEGF、VEGFR2蛋白表达进一步明显升高，表明黄芪甲苷可能通过增强PI3K/AKT/eNOS通路的基因转录及蛋白磷酸化水平，提高血管生成因子表达，进而加速创面组织的愈合及血管生成。为进一步验证，本实验在涂抹高剂量黄芪甲苷的同时抑制PI3K的表达，发现PI3K/AKT/eNOS通路相关蛋白磷酸化水平明显降低，且VEGF、VEGFR2蛋白相对表达量明显降低，同时各时间段的创面愈合率和创面血管化面积比均明显降低，皮肤组织内上皮细胞及胶原数量减少，表明黄芪甲苷可通过调控PI3K/AKT/eNOS信号通路，增强相关蛋白磷酸化，从而加速创面愈合及血管生成。

综上所述，黄芪甲苷可通过调控PI3K/AKT/eNOS信号通路，增强PI3K/AKT/eNOS通路相关基因mRNA表达及蛋白磷酸化水平，提高VEGF、VEGFR2蛋白的表达，促进上皮细胞及胶原生成，加速创面组织愈合及血管生成。但黄芪甲苷是否还有其他作用途径间接参与调控皮肤创面愈合，还需更多实验加以说明。