周慧敏，马秀梅，曾海生，黄俞盛，谭 方

（1.桂林市中医医院，广西 桂林 541002；2.广西中医药大学，广西 南宁 530200）

金银花是临床常用中草药，《中华本草》记载其是忍冬干燥花蕾或带初开的花，属于忍冬科忍冬属植物[1-2]。金银花主要的功效是清热解毒、抗炎等，临床上常用于治疗温病发热和热毒痈疡等病症[3-5]。金银花主要含有黄酮类、有机酸类、三萜皂苷等化学成分[6-9]。现代药理研究表明，金银花作为常用中药既能宣散风热，还具有清热解毒，抗炎、降脂和利胆保肝等作用，用于治疗各种感染、炎症、高脂血症等[7,10]。金银花抗炎、降血脂作用及机制通路的相关研究报道较少，因此本研究通过研究金银花醇提物的抗炎、降血脂作用，为该药材的进一步研究和开发应用提供实验依据。

1 材 料

1.1 实验动物6周龄健康SPF级雄性昆明种小鼠360只，体质量18～22 g；7周龄SPF级雄性SD大鼠60只，体质量180～220 g，均购买于广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（桂）2019-0002。实验前在实验室适应性饲养4 d，实验动物使用许可证号：SYXK（桂）2018-0014。实验鼠分笼饲养于空调室内，湿度（68±5）%，室温（23±2）℃，照明时间随同自然昼夜变化，常规饲养，自由进食和饮水。实验方案经广西中医药大学伦理委员会批准。实验过程中对所有动物的处置符合国家科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

1.2 药物与试剂角叉菜胶（批号：YY19754）购自上海源叶生物科技有限公司；醋酸地塞米松（批号：190119，规格：0.75 mg）购自浙江仙琚制药股份有限公司；伊文思蓝（批号：20190725）购自国药集团化学试剂有限公司；辛伐他汀片（批号：20190405）购自涿州东乐制药有限公司，临用前使用纯水配置成0.4 mg/mL溶液用于灌胃；丙二醛（MDA）试剂盒（批号：201901）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号：201905）、一氧化氮（NO）试剂盒（批号：201903）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号：1904101）、总胆固醇（TC）试剂盒（批号：1904101）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒（批号：1904062）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号：1904091）均购自南京建成生物工程技术研究所。

1.3 主要仪器酶标仪（Tecan Austria GmbH）；UV-1780型紫外可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]；LRH-300-S型恒温恒湿培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；BS-280型全自动生化分析仪（迈瑞医疗）；BSA224S型电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；YXQ-50A型立式压力蒸汽灭菌器（上海迅博实业有限公司医疗设备厂）。

2 实验方法

2.1 金银花醇提物的制备及高脂饲料的配方及配制取金银花粗粉6 kg，加80%乙醇回流提取2次，第一次提取时间为1.5 h，溶剂倍量为10倍，第二次提取时间为1 h，溶剂倍量为8倍，过滤，合并滤液，减压浓缩，再置水浴锅上挥干溶剂，称质量，计算得膏率。

高脂饲料购于广西医科大学实验动物中心，由10%猪油、1.0%胆固醇、0.2%胆酸钠、3.0%蔗糖和5.0%蛋黄粉组成，在80℃烘箱内烘干。

2.2 金银花醇提物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响随机取雄性昆明种小鼠72只，按随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（地塞米松5 mg/kg）、金银花醇提物高剂量组（40 g/kg）、金银花醇提物中剂量组（25 g/kg）、金银花醇提物低剂量组（15 g/kg），每组12只。按照药理实验规程，给药体积是1 mL/50 g，空白对照组和模型对照组小鼠灌胃给予等体积纯净水，1次/d，连续给药7 d。最后一次给药1 h后，除空白对照组外，其他各组在小鼠右耳正反两面涂上10 μL二甲苯致炎，15 min后处死小鼠，剪下小鼠两耳，在两耳相同部位用6 mm打孔器等面积打下圆耳片，精密称质量，计算肿胀度和肿胀抑制率。计算公式：肿胀度（mg）=右耳质量（mg）-左耳质量（mg）。肿胀抑制率=[（模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/模型组平均肿胀度]×100%。

2.3 金银花醇提物对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响随机选取雄性昆明种小鼠72只，分组、给药方法同“2.2”项。最后一次灌胃给药1 h后，除空白对照组外，其他各组小鼠给予0.3%伊文思蓝溶液（1 mL/100 g）尾静脉注射，同时给予0.6%冰醋酸溶液（0.2 mL/20 g）腹腔注射；空白对照组小鼠给予生理盐水（1 mL/100 g）尾静脉注射，同时给予生理盐水（0.2 mL/20 g）腹腔注射。15 min后处死小鼠，注射6 mL生理盐水冲洗腹腔，轻揉腹部1 min，剪开小鼠腹腔吸取腹腔液，2 500 r/min离心12 min，吸取上清液至比色皿中，在590 nm处，使用紫外可见分光光度计测定其吸光度[11]。

2.4 金银花醇提物对角叉菜胶致小鼠足趾肿胀及踝关节的影响随机选取雄性昆明种小鼠72只，分组、给药方法同“2.2”项。最后一次灌胃给药1 h后，除空白对照组外，其他各组小鼠右后足趾部皮下注射1%角叉菜胶溶液0.02 mL致炎，空白对照组小鼠右后足趾部皮下注射生理盐水0.02 mL，致炎16 min后处死小鼠，剪取后双足相同部位，称质量。计算公式：肿胀度（mg）=右后足趾质量（mg）-左后足趾质量（mg），并计算肿胀抑制率。肿胀抑制率=[（模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）/模型组平均肿胀度]×100%。实验结束后，剖取组织，经4%多聚甲醛溶液固定脱钙、脱水、包埋、切片、HE染片后封片，观察踝关节病理改变情况并拍照。

2.5 金银花醇提物对二甲苯致摘除双侧肾上腺小鼠耳肿胀的影响随机选取雄性昆明种小鼠72只，手术前1 d用头孢克肟（60 mg/kg）灌胃给药。术前用120℃的压力蒸汽对手术器械进行灭菌15 min，用75%酒精对手术台及手套消毒，用5%水合氯醛（10 mL/kg）对小鼠进行麻醉，减去背上鼠毛，75%酒精对皮肤局部消毒。沿背部正中线开约0.5 cm长的肌肉切口。用镊子小心拨开切口，小心分开小鼠腹腔组织与脏器，用镊子夹住肾脏与肾上腺之间的组织，摘除小鼠腺体。同法摘除小鼠另一侧肾上腺。用棉球稍止血后缝合，涂以适量的碘伏，术后第2天以头孢克肟灌胃给药，术后第3天以5%葡萄糖生理盐水溶液代替纯净水饲养术后小鼠[11]。之后按“2.2”项方法进行小鼠耳肿胀实验。

2.6 金银花醇提物对角叉菜胶致摘除双侧肾上腺小鼠足趾肿胀，足趾MDA、NO含量和SOD活性，以及踝关节的影响取剩余雄性昆明种小鼠72只，摘除小鼠双侧肾上腺方法同“2.5”项。分组、给药方法同“2.2”项。随后剪碎右足，取4 mL生理盐水浸泡[11-12]。手动研磨匀浆后，3 000 r/min离心12 min，取离心后的上清液冻存于-20℃。使用ELISA法测定MDA、NO含量和SOD活性，实验操作参照试剂盒说明书。实验结束后，剖取组织，经4%多聚甲醛溶液固定脱钙、脱水、包埋、切片、HE染片后封片，观察踝关节病理改变情况并拍照。

2.7 金银花醇提物对SD雄性大鼠高脂血症的影响取SD雄性大鼠60只，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、金银花醇提物高剂量组、金银花醇提物中剂量组、金银花醇提物低剂量组，每组10只。除空白组对照外，其余各组大鼠以高脂饲料饲养并饮用自来水；空白对照组大鼠以基础饲料饲养并饮用自来水。28 d后，禁食不禁水12 h，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，按照试剂盒说明书，使用全自动生化仪测定血清中指标TC、TG和HDL-C的含量水平。与空白对照组比较，造模大鼠体质量、TC、TG明显升高，HDL-C明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明大鼠高脂血症模型造模成功。判断模型复制成功后开始给药，阳性对照组大鼠根据体质量每天以10 mL/kg的量给予辛伐他汀溶液（0.4mg/mL）；金银花醇提物高、中、低剂量组大鼠以每天10 mL/kg的量分别给予金银花醇提物的CMC-Na溶液，40、25、15 g/kg；模型对照组和空白对照组大鼠按体质量给予10 mL/kg的CMC-Na溶液[13-14]。每3天称1次体质量，28 d后，禁食不禁水12 h，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min分离血清，按照试剂盒说明书测定血清中指标TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量。

2.8 统计学方法采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”（±s）表示，经正态性检验和方差齐性检验，多组比较用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠耳肿胀度及肿胀抑制率比较与空白对照组比较，模型对照组小鼠耳肿胀度明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物低、中、高剂量组小鼠耳肿胀度均明显降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，金银花醇提物低剂量组小鼠耳肿胀度明显升高（P＜0.05）；金银花醇提物高、中剂量组小鼠耳肿胀度与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性对照组、金银花醇提物高剂量组、金银花醇提物中剂量组、金银花醇提物低剂量组小鼠耳肿胀抑制率分别为55.10%、53.88%、50.61%、37.55%。（见表1）

表1 各组小鼠耳肿胀度比较

3.2 各组小鼠腹腔毛细血管通透性比较与空白对照组比较，模型对照组小鼠腹腔毛细血管通透性明显增加（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物低、中、高剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性均明显减轻（P＜0.05）；与阳性对照组比较，金银花醇提物低剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性明显增加（P＜0.05）；金银花醇提物高、中剂量组小鼠腹腔毛细血管通透性与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组小鼠腹腔毛细血管通透性比较（±s）

表2 各组小鼠腹腔毛细血管通透性比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只） 给药剂量（g/kg） 腹腔液OD值空白对照组 12 - 0.101 5±0.086 2模型对照组 12 - 0.302 8±0.129 7a阳性对照组 12 0.005 0.130 9±0.084 8b金银花醇提物高剂量组12 40.000 0.164 1±0.067 2b金银花醇提物中剂量组12 25.000 0.177 8±0.095 8b金银花醇提物低剂量组12 15.000 0.206 7±0.082 6b c

3.3 各组小鼠踝关节病理情况比较空白对照组小鼠踝关节软骨表面光滑，关节腔无渗出物，滑膜细胞排列整齐；模型对照组小鼠踝关节滑膜组织结构异常，胶原纤维排列紊乱（红色箭头所示），少量炎症细胞浸润（黑色箭头所示）；阳性对照组小鼠踝关节软骨光滑，关节腔内见少量渗出物，滑膜细胞整齐，见少许炎症细胞浸润；金银花醇提物中、低剂量组小鼠踝关节胶原纤维排列整齐（黑色箭头所示），可见少量脂肪细胞；金银花醇提物高剂量组小鼠踝关节软骨较光滑，关节腔见少许渗出物，滑膜细胞大体整齐排列，见少许炎症细胞浸润。（见图1）

图1 各组小鼠踝关节病理切片图（HE，×200）

3.4 各组小鼠足趾肿胀度及肿胀度抑制率比较与空白对照组比较，模型对照组小鼠足趾肿胀度明显增加（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物低、中、高剂量组小鼠足趾肿胀度均明显减轻（P＜0.05）；与阳性对照组比较，金银花醇提物低剂量组小鼠足趾肿胀度明显增加（P＜0.05）；金银花醇提物高、中剂量组小鼠足趾肿胀度与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性对照组、金银花醇提物高剂量组、金银花醇提物中剂量组、金银花醇提物低剂量组小鼠足趾肿胀抑制率分别为58.48%、54.08%、46.30%、20.61%。（见表3）

表3 各组小鼠足趾肿胀度比较

3.5 各组摘除双侧肾上腺小鼠耳肿胀度及耳肿胀抑制率比较与空白对照组比较，模型对照组小鼠耳肿胀度明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物中、高剂量组小鼠耳肿胀度明显降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，金银花醇提物低剂量组小鼠耳肿胀明显升高（P＜0.05），而金银花醇提物高、中剂量组小鼠耳肿胀度与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性对照组、金银花醇提物高剂量组、金银花醇提物中剂量组、金银花醇提物低剂量组小鼠耳肿胀度抑制率分别为56.45%、39.17%、33.79%、11.39%。（见表4）

表4 各组摘除双侧肾上腺小鼠耳肿胀度比较

3.6 各组摘除双侧肾上腺小鼠足趾肿胀度及肿胀度抑制率比较与空白对照组比较，模型对照组小鼠足趾肿胀度明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物中、高剂量组小鼠足趾肿胀度明显降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，金银花醇提物低剂量组小鼠足趾肿胀度明显升高（P＜0.05），而金银花醇提物高、中剂量组小鼠足趾肿胀度与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。阳性对照组、金银花醇提物高剂量组、金银花醇提物中剂量组、金银花醇提物低剂量组小鼠足趾肿胀抑制率分别为50.42%、42.88%、36.34%、18.24%。（见表5）

表5 各组摘除双侧肾上腺小鼠足趾肿胀度比较

3.7 各组摘除双侧肾上腺小鼠足趾炎性部位中MDA、NO含量及SOD活性比较与空白对照组比较，模型对照组小鼠足趾部位MDA、NO含量及SOD活性明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物中、高剂量组小鼠足趾炎性部位MDA、NO含量及SOD活性均明显降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，金银花醇提物低剂量组小鼠足趾炎性部位MDA、NO含量及SOD活性均明显升高（P＜0.05）；而金银花醇提物高、中剂量组小鼠足趾炎性部位MDA、NO含量及SOD活性与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表6）

表6 各组摘除双侧肾上腺的小鼠足趾炎性部位MDA、NO含量及SOD活性比较（±s）

表6 各组摘除双侧肾上腺的小鼠足趾炎性部位MDA、NO含量及SOD活性比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）MDA（nmol/L）SOD（pg/mL）NO（μmol/L）空白对照组 12 - 1.20±0.15 10.12±1.32 9.92±1.20模型对照组 12 - 2.71±0.22a 21.45±1.27b 21.67±1.25a阳性对照组 12 0.005 1.85±0.14b 12.21±2.01a 13.91±0.82b金银花醇提物高剂量组12 40.000 2.15±0.11b 15.99±1.20b 14.27±1.02b金银花醇提物中剂量组12 25.000 2.26±0.13b 15.13±1.18b 16.24±1.01b金银花醇提物低剂量组12 15.000 2.37±0.21c 14.40±1.15c 17.01±1.13c

3.8 各组摘除双侧肾上腺小鼠踝关节病理情况比较空白对照组小鼠踝关节软骨表面光滑，关节腔无渗出，滑膜细胞排列整齐；模型对照组小鼠踝关节滑膜组织结构异常，胶原纤维排列有些紊乱，有少许炎症细胞浸润；阳性对照组小鼠踝关节软骨光滑，关节腔内见少量渗出物，滑膜细胞整齐，可见少许炎症细胞浸润；金银花醇提物高剂量组小鼠踝关节软骨略光滑，关节腔见少许渗出物，滑膜细胞大体整齐排列，可见少许炎症细胞；金银花醇提物中、低剂量组小鼠踝关节胶原纤维排列整齐，可见少量脂肪细胞。高、中、低剂量金银花醇提物对炎症的影响，随着金银花醇提取物剂量的增加，症状有一定缓解。（见图2）

图2 各组摘除双侧肾上腺小鼠踝关节病理切片图（HE，×200）

3.9 大鼠高脂血症模型建立大鼠高脂饲料饲养28 d后，模型对照组、阳性对照组及金银花醇提物高、中、低剂量组大鼠体质量、TC、TG明显高于空白对照组（P＜0.05或P＜0.01），而HDL-C明显低于空白对照组（P＜0.05），表明大鼠高脂血症模型造模成功。（见表7）

表7 各组大鼠体质量增值及TC、TG、HDL-C含量比较（±s）

表7 各组大鼠体质量增值及TC、TG、HDL-C含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05，bP＜0.01

组别 动物数（只）体质量增值（g）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）空白对照组 10 102.36±11.58 1.50±0.36 0.53±0.32 0.29±0.12模型对照组 10 128.75±13.02a 5.26±1.04b 0.88±0.20a 0.24±0.10a阳性对照组 10 126.91±10.15a 5.02±0.41b 0.82±0.11a 0.26±0.06a金银花醇提物高剂量组 10 127.70±9.72a 5.34±0.37b 0.76±0.12a 0.27±0.08a金银花醇提物中剂量组 10 125.98±8.63a 4.85±0.58b 0.80±0.09a 0.25±0.06a金银花醇提物低剂量组 10 129.01±11.30a 5.41±0.42b 0.73±0.10a 0.28±0.05a

3.10 各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比较与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量明显升高（P＜0.05）；与模型对照组比较，阳性对照组和金银花醇提物高、中、低剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量均明显降低（P＜0.05）；金银花醇提物高、中、低剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。6组大鼠血清HDL-C含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表8）

表8 各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比较（±s）

表8 各组大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比较（±s）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型对照组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05

组别 动物数（只）给药剂量（g/kg）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）空白对照组 10 - 1.48±0.12 0.46±0.15 0.38±0.09 1.98±0.12模型对照组 10 - 5.16±0.45a 0.79±0.12a 0.28±0.07 4.57±0.43a阳性对照组 10 0.004 4.15±0.61b 0.48±0.10b 0.32±0.05 3.45±0.28b金银花醇提物高剂量组10 40.000 4.20±0.30b 0.47±0.13b 0.32±0.09 3.43±0.41b金银花醇提物中剂量组10 25.000 4.32±0.46b 0.43±0.11b 0.31±0.08 3.65±0.32b金银花醇提物低剂量组10 15.000 4.41±0.32b 0.45±0.09b 0.31±0.10 3.83±0.40b

4 讨 论

一氧化氮（NO）是一种重要的炎症介质，能够诱导机体促炎因子的产生，如白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等[15]。超氧化物歧化酶（SOD）具有特殊的生理活性，是生物体内的抗氧化酶，能清除自由基。本研究通过检测去肾上腺小鼠足趾肿胀部位炎症因子水平发现，金银花醇提物通过降低MDA、NO含量，提高SOD含量发挥抗炎作用，且抗炎作用可能依赖下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPAA）系统。金银花醇提物具有明显的抗炎作用。与空白对照组比较，高、中剂量金银花醇提物对小鼠耳肿胀有明显的抑制作用（P＜0.05）；高、中、低剂量金银花醇提物对小鼠腹腔毛细血管通透性及对角叉菜胶致小鼠足跖肿胀均有明显抑制作用（P＜0.05）；与空白对照组比较，在摘除双侧肾上腺小鼠模型中，高、中剂量金银花醇提物可显著抑制二甲苯致该模型小鼠耳肿胀和角叉菜胶致该模型小鼠足跖肿胀（P＜0.05）；高、中、低剂量金银花醇提物均能够显著降低足趾中MDA、NO水平和SOD活性（P＜0.05）；高、中、低剂量金银花醇提物能够明显降低高血脂症模型大鼠血清中TC、TG和LDC-C水平。提示金银花醇提物对实验性高脂血症有一定的防治作用。

炎症的发生发展过程一般分为3期，早期以毛细血管扩张、通透性亢进为主，中期为血小板吸附及白细胞游走，晚期为肉芽组织增生[16]。炎性反应是由机体中多种炎症介质参与，炎症因子与机体不断斗争直至达到一个动态平衡的过程，而中药是通过多途径，多环节发挥抗炎作用的[17-19]。目前国内外在中药抗炎、降血脂方面而进行的研究也越来越广泛和深入，对于开发具有新作用靶点和高效低毒的新型抗炎、降血脂中药，阐明抗炎、降血脂中药的物质基础及作用机制有着重大意义。目前金银花药材的应用广泛，为了在临床上安全有效地利用该药材，我们对金银花药材提取物抗炎、降血脂作用进行了相关研究。在前期研究工作中，我们发现金银花提取物有明显的抗炎、降血脂调节作用。金银花醇提物能明显降低大鼠血清中的TC、TG和LDL-C含量水平。课题组结合前期研究基础推测金银花可能含有某种或者某一类活性成分能刺激免疫系统、促进血液的净化能力，加快清除血液垃圾，对生物组织产生的降血脂作用起着很好的机体调节功能。

下丘脑-垂体-肾上腺（HPAA）系统是人体重要的神经内分泌轴，其对机体的炎症具有重要的调节作用[20-22]，本研究发现，金银花醇提取物具有明显的抑制小鼠足趾肿胀、改善机体炎症作用。本实验通过建立去双侧肾上腺小鼠模型，在切除机体内分泌系统的影响下，考察金银花醇提取物对小鼠耳肿胀度、小鼠足趾肿胀度的影响以及SOD、MDA、NO水平的变化。实验结果表明，金银花醇提取物对小鼠耳肿胀度、足趾肿胀度有一定的抑制作用，且小鼠足趾部位MDA、SOD、NO水平发生明显的变化。金银花醇提物具有抗炎活性，其抗炎作用的发挥可能依赖下丘脑-垂体-肾上腺（HPAA）系统，同时金银花醇提物的抗炎作用机制与降低MDA、NO含量和SOD活性有关。