彭利君 方婷婷 蔡龙

当前，结核病(tuberculosis，TB)仍然是严重危害人类健康的重大传染病，特别是新型冠状病毒肺炎的全球大流行给全球TB的防控带来了新的挑战[1-2]。据估计约有40%的TB患者由于诊断率过低而未能及时确诊和报告[3]。因此，TB的快速诊断对于患者早诊断、早治疗、临床预后和传播极为重要。结核分枝杆菌循环游离DNA(Mycobacteriumtuberculosiscirculating free DNA，MTB-cfDNA)可表明病原体的存在，是TB诊断和治疗监测有吸引力的生物标志物。本文将对血液、尿液及胸、腹腔积液和脑脊液标本的检测现状进行综述，综合评价MTB-cfDNA对TB的诊断效果，并对基于cfDNA的TB检测开发的主要挑战进行总结。

一、常用TB检测方法和新的cfDNA检测

分枝杆菌培养是TB诊断的金标准，但检测周期较长；痰涂片显微镜检查和血清结核抗体便宜、简单、快速，且后者生物风险低，但两者敏感性均较低；γ-干扰素释放试验的敏感度和特异度良好，但结果易受宿主年龄、疾病和免疫状态的影响，也不能确定是否为活动性TB[4]。而尚处于研究阶段的血清蛋白检测因与其他慢性肺部疾病有重叠，缺乏诊断特异性，通常需要检测一组蛋白才能进行结核病诊断[5-6]。近年来，已经开发了较多针对MTB基因组DNA的快速分子检测方法，例如实时定量PCR，以及世界卫生组织认可的环介导等温扩增技术、GeneXpert MTB/RIF和Xpert Ultra等[7-8]。然而，这些方法通常检测痰液等呼吸道标本，对难以提供痰液的肺结核(pulmonary tuberculosis，PTB)患者(如儿童、长期卧床等咳痰困难患者)和通常需要侵入性活检的非呼吸道标本的肺外结核(extrapulmonary tuberculosis，EPTB)患者的适用性有限，而现有的诊断方法并未针对这些样本进行优化。

cfDNA也被称为细胞游离DNA(cell-free DNA)或无细胞DNA，于1948年首次在人类血液中被发现[9]。cfDNA是存在于人体血液和其他体液的无细胞部分的核酸片段[10]，即将死亡的人类细胞和微生物分解时将cfDNA释放入血液，随着血液循环进入体液的各个组分，可通过PCR或测序进行分析。cfDNA的特征和数量可在不同的生理和疾病条件下发生改变，这可能是由于宿主细胞在恶性肿瘤、生理状态(如妊娠)和存在传染源(如病毒、细菌或寄生虫)等情况下的过度损伤或更替导致[9]。cfDNA在癌症检测[11-13]、器官移植监测[14]、产前基因筛查[15]等方面的应用已较为成熟，如早在1999年就有使用cfDNA检测EB病毒筛查鼻咽癌的报道[16]，在诊断侵袭性真菌[17]、寄生虫和HIV等感染方面也有报道[10, 18-19]。对于TB诊断，cfDNA是一种很有潜力的生物标志物，在胸腔积液、腹腔积液和脑脊液等体液样本中检测MTB-cfDNA显示出比GeneXpert MTB/RIF等基因组DNA更高的TB诊断准确度[20-27]，而血液和尿液中检测MTB-cfDNA适用于任何年龄组患者，尤其是无痰的PTB患者和EPTB患者。

二、血液标本的MTB-cfDNA检测

血液cfDNA诊断TB的敏感度在不同的研究中差异较大，介于27%～100%之间[28-34]，可能与多个原因相关。其一，MTB-cfDNA在血液中含量甚微，易受血液中含量较高的核酸(包括DNA、rRNA、mRNA等)、蛋白质及其他物质的影响，使目标核酸提取不足[28, 30]。其二，检测靶标和检测方法不一致也可能是一个原因。从以往的研究来看，以IS6110为靶标能获得更好的检测敏感度和特异度，相对于其他检测方法数字PCR的检测结果更好(表1)。2021年Pan等[33]的前瞻性研究证实，在2名结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)者的血液中检出MTB-cfDNA，这提示血液中MTB-cfDNA的检测可用于筛查LTBI者，但需要更大规模的队列研究或使用更敏感的方法来评估其在该人群中的应用价值。

三、尿液标本的MTB-cfDNA检测

70%以上的血浆cfDNA小于300 bp，峰值长度为160～167 bp[35-37]，这将允许其穿过肾小球屏障进入尿液中，且尿液中的MTB-cfDNA平均片段长度(19～52 bp)明显短于人基因组cfDNA(42～92 bp)[38]。尿液MTB-cfDNA诊断TB的敏感度和特异度分别为43%～83.7%和89%～100%的范围内[39-43]，且检测的敏感度随着扩增产物长度的减少而增加[40]。但不同的提取方法在捕获尿液中短、微量cfDNA的能力上存在较大差异[37]，其中Oreskovic和Lutz[40]、Oreskovic等[41]开发的一种超灵敏探针杂交方法表现优异。该方法使用固定在磁珠上的序列特异性寡核苷酸捕获探针来提取10 ml尿液样本中的MTB-cfDNA，有效捕获和扩增短至25 bp的片段，检测限可达0.5 copies/ml，敏感度和特异度分别达到了83.7%和100%。

与传统的PTB诊断标本类型相比较，尿液是一种易于收集、样本量大、生物安全风险低的样本，从尿液中检出MTB可能可以发现许多未得到充分检测的TB人群，尤其是那些细菌载量低的人群，包括儿童和患有EPTB的人群，尿液cfDNA是十分有潜力的MTB诊断生物标志物。但由于尿液中MTB-cfDNA 的片段短，应该更加关注cfDNA的富集和提取，因此，设计针对超短片段的样本制备和扩增方法至关重要。

四、胸、腹腔积液和脑脊液标本的MTB-cfDNA检测

胸、腹腔积液和脑脊液cfDNA诊断TB的敏感度为53%～100%，特异度为96%～100%[20-22]，其敏感度高于培养和GeneXpert MTB/RIF约2～4倍，可能由以下两个原因造成：首先，胸、腹腔积液和脑脊液处于相对封闭的环境，大部分MTB被体内免疫细胞吞噬后，经溶酶体降解释放出大量的cfDNA，由于胸膜和腹膜都有半透膜特性，cfDNA不易透过，使得cfDNA浓度较高；而GeneXpert MTB/RIF检测的是沉淀中完整菌体的基因组DNA，相对MTB-cfDNA而言浓度更低，这可能是其敏感度低于MTB-cfDNA检测的主要原因[21-24]。其次，GeneXpert MTB/RIF检测的是RNA聚合酶rpoB基因的81 bp耐药决定区的单拷贝基因，而MTB-cfDNA 检测的是MTB特异性多拷贝重复插入序列IS6110。Haldar等[24-25]研究表明，结核性脑膜炎患者脑脊液的沉淀物检测MTB的敏感度较滤液低2～3倍，提示滤液较沉淀物是更好的诊断疑似结核性脑膜炎的分子检测样本。

五、综合评价MTB-cfDNA对TB的诊断效能

考虑到是世界卫生组织发布的目标产品的特性，推荐非痰标本生物标志物检测的最低可接受敏感度和特异度分别为65%和98%、最佳敏感度和特异度分别为80%和98%[44]，依据目前研究的性能结果，MTB-cfDNA未来极有可能成为TB检测主要的生物标志物。表1总结了国内外MTB-cfDNA诊断TB研究的性能评估，数据显示不同样本类型的MTB-cfDNA诊断敏感度不同，用途也可能不同。对于获得呼吸道样本有困难的人群，检测其尿液和血液的MTB-cfDNA会更有优势，预测未来尿液样本的cfDNA检测有可能用于常规TB筛查，而血液cfDNA检测有可能在LTBI筛查方面有所突破；另外，相比于GeneXpert MTB/RIF等基因组DNA诊断TB，检测胸、腹腔积液和脑脊液的cfDNA 看起来是更好的选择。

六、开发基于cfDNA诊断TB检测方法的主要挑战

cfDNA广泛用于临床需要进一步提高其敏感度，面临的挑战主要包括以下几个方面：

1.标准化的前处理程序：体液中的cfDNA浓度较低，当进行PCR检测时，其效率主要取决于分离方法的质量控制和稳健性。进行适当的样品前处理(即在扩增和检测步骤之前进行样品处理)是提高检测敏感度的关键点之一[45]。cfDNA的前处理程序包括：样品采集(采集多大样本量、使用何种收集管)、样品储存(防腐剂)、cfDNA 提取(最佳的提取试剂盒/方法)及其提取物的储存(-20 ℃和-80 ℃可以储存多长时间)。

表1 国内外结核分枝杆菌cfDNA诊断结核病的性能评估

样本离心取上清或用0.22 μm滤膜过滤的前处理步骤可以避免提取到沉淀中的基因组DNA稀释cfDNA。目前市售的提取试剂盒对MTB-cfDNA的提取都是非特异性的，参考Oreskovic和Lutz[40]、Oreskovic等[41]开发的特异捕获病原cfDNA的核酸富集方式，为提高以cfDNA为靶标诊断其他疾病的敏感度提供了新的思路。Murugesan等[46]对影响血液和尿液中病原体cfDNA分析前的变量的研究表明，对于血液标本最好使用K2EDTA抗凝的采血管，而尿液标本最好使用Tris-EDTA作为防腐剂。使用防腐剂后血液和尿液标本可以在室温下延迟处理24 h。在-80 ℃保存24周后，新鲜和解冻血浆与尿液间没有观察到显著差异，且使用更大的样本量能获得更多cfDNA。EI Messaoudi等[45]建议血液样本进行两次离心，而Murugesand等[46]发现两次离心(第一次500×g、第二次16 000×g)会使血液样本的cfDNA浓度下降，这可能是由于第二次离心力过大导致白细胞基因组DNA释放，降低cfDNA的比例，造成cfDNA被稀释。这些发现表明，使用防腐剂后延迟24 h处理大容量单次离心的K2EDTA血浆和Tris-EDTA尿液可能会优化cfDNA检测。此外，也需要MTB-cfDNA标准品作为质量控制，以验证cfDNA不同的检测方法，最终实现以检测体液MTB-cfDNA 浓度来进行临床诊断和治疗监测。

2.需要大规模的临床验证：从患者数量来看，既往研究的患者数量不多，需要更大规模的队列研究进行临床验证来评估MTB-cfDNA在TB中的应用价值。从研究人群来看，在特定人群中的研究，特别是基于MTB-cfDNA的HIV感染者诊断的研究数量有限，针对儿科患者的研究更是极少。对于这些难以留取痰液的人群，更适合检测体液中MTB-cfDNA进行诊断，因此更需要进行大规模的临床验证。

七、展望

由于新型冠状病毒肺炎的大流行，我国的集中检测能力有所提高，未来TB的快速分子筛查可能受益于这些进步。cfDNA可以识别身体任何部位的结核感染，并有可能检测出目前传统微生物学方法无法识别的疾病状态(如LTBI)。除了检测MTB外，分析cfDNA还可以使我们更深入地了解其遗传特征[47]，如耐药基因等，以指导临床用药。但值得注意的是，病原体cfDNA不如基因组DNA稳定，尤其在患者治疗后，其体内病原体cfDNA会很快被免疫细胞清除[43]，若仍可检测到MTB-cfDNA，则很可能是新释放到体液循环中的MTB，故认为检测MTB-cfDNA可用于反映当前的疾病状况，对治疗有监测作用。

总之，cfDNA作为TB诊断生物标志物的研究仍处于起步阶段，未来需要更大型、纳入患者类型更全面的临床研究来评估其效用。随着检测cfDNA方法的进一步优化，其敏感度和特异度将进一步提高，有助于改善TB诊断，并很可能使其成为“游戏规则的改变者”。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献彭利君：文章撰写和修改；方婷婷：文献查找；蔡龙：文章修改和审阅