王清森，吴 静,3，周家伟，刘亚锋，成安琪，胡 东,3

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一[1]，许多国家的发病率和死亡率还在持续上升[2]。多项研究[3-4]提出了包含年龄、性别和肿瘤分级等在内的预后因素，用于预测HCC患者的生存状态，但目前HCC的发病机制仍未完全阐明。近年来，靶向药物治疗HCC获得了很多突破性进展，索拉非尼、青蒿琥酯(artesunate，ART)、吉非替尼等都体现出了治疗HCC的潜力[5-6]。但目前HCC全身治疗药物的疗效仍不能让人满意，这需要更加深入地研究HCC发生发展机制，探寻药物的新靶点。前期研究[7]表明ART可以联合索拉非尼抑制HCC的进展，该研究通过网络药理学和生物信息学对ART治疗HCC的潜在靶点和详细分子机制进行深入探讨，并通过实验证明ART的详细作用机制及通路，为临床治疗HCC提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料SK-HEP-1细胞为安徽理工大学医学院常规保存；ART(大连美仑生物技术有限公司)；DMEM培养基、胰酶和优质胎牛血清(美国Gibco公司)；6孔细胞培养皿(美国Corning公司)；TRIzol试剂、逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技中国有限公司)；荧光定量PCR试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成；RIPA裂解液、5×SDS上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；PVDF膜和ECL曝光液(美国Millipore公司)；FABP5兔单克隆抗体(美国CST公司，#39926T)，PI3K兔单克隆抗体(美国Abcam公司，#ab32089)，p-PI3K兔单克隆抗体(美国Abcam公司，#ab278545)，AKT兔单克隆抗体(美国CST公司，#4685S),p-AKT兔单克隆抗体(美国CST公司，#4060T)，β-actin兔多克隆抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司，#AC026)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗(赛默飞世尔科技中国有限公司，#C31460)。MTS试剂盒[普洛麦格(北京)生物技术有限公司，#G3580]。高速台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司,型号：centrifuge 5417R)；酶标仪(美国Agilent公司，型号：Epoch 2)；梯度基因扩增仪(珠海黑马医学仪器有限公司，型号:Hema 9600)；实时荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技中国有限公司，型号：Quantstudio 3)；凝胶成像仪(英国Amersham公司，型号：ImageQuant 800)；倒置荧光显微镜(德国Leica公司，型号：DMi8)。

1.2 方法

1.2.1ART靶点预测 从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载药物ART的3D结构， 将药物3D结构上传到PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)数据库(PharmMapper数据库是基于药物的效应基团的立体结构来筛选其潜在的特异性靶标，找到药物分子-潜在靶标之间最佳的映射姿势，是重要的计算钓靶服务器[8])，运行得到CSV格式结果文件。将所得到的靶点基因导入 UniProt 数据库，限定物种为“human”，将检索得到的所有蛋白靶标校正为UniProt ID，并得到靶标蛋白所对应的基因名。

1.2.2药物-靶点相互作用网络构建 把所有ART对应的靶点基因导入STRING数据库(https://string-db.org/)，限定物种“Homo sapiens”，并以置信度≥0.8，隐藏离散的点，得到潜在作用靶点与药物互作关系。随后在Cytoscape 3.6.1软件中将药物-靶点互作网络可视化。

1.2.3TCGA数据库分析 从癌症基因组图谱数据库(TCGA，https://portal.g dc.Cancer.gov/)下载50例HCC癌旁样本和374例HCC样本的RNA测序数据集以及相应的临床数据。提取靶点基因在HCC中的表达量，用R包(limma和pheatmap)提取差异表达基因，做出基因差异表达热图和火山图。对差异表达基因进行COX单因素和多因素回归分析，筛选关键靶点基因。

1.2.4分子对接 从ZINC(http://zinc.docking.org/)数据库下载ART的mol2格式文件。从 PDB 数据库下载靶标的晶体结构，并运用PyMOL软件进行预处理，包括去除水分子、加氢等。利用 Auto Dock Tools软件将靶标晶体结构转换为 pdbqt 格式文件，并导入ART的mol2格式文件，随后进行分子对接[9]。通过结合能评价ART和靶点的结合活性，最后运用 PyMOL 软件使对接文件可视化。

1.2.5GEPIA2数据库验证 从GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)验证关键靶点基因在肝癌组织和正常组织中的表达，并对关键靶点基因进行预后分析。

1.2.6靶点通路富集分析 利用R包(clusterProfiler)对获得的靶标进行KEGG 通路分析，进一步研究ART作用于HCC细胞的分子机制。

1.2.7划痕实验 收集处于对数生长期的SK-HEP-1细胞，以5×105个/ml分别接种于细胞培养皿中，对照组加DMSO，实验组加100 μmol/L ART，直至90%融合，用10 μl无菌枪头比着直尺用力划横线；无菌 PBS 轻轻冲洗细胞3次，洗去脱落的细胞，加入无血清培养基，继续培养24、48 h，分别于0、24、48 h拍摄图像。

1.2.8MTS实验 收集处于对数生长期的SK-HEP-1细胞，以每孔5×103个接种于96孔板中，每组设置3个复孔。待细胞贴壁后，实验组加入100 μmol/L ART,对照组加入DMSO，放入37 ℃、5% CO2培养箱中分别培养 24、48、72 h后，向每孔加入20 μl MTS继续培养4 h。然后再用酶标仪测定 490 nm处的吸光度，该实验重复3次。

1.2.9实时荧光定量PCR 使用TRIzol试剂提取细胞总RNA成分，逆转录获得cDNA，存于-20 ℃冰箱备用。使用SYBR Green试剂盒在荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR检测。使用GAPDH作为内参基因。FABP5上游引物为5′-TGAAGGAGCTA GGAGTGGGAA-3′,下游引物为5′-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3′,产物长度212 bp；GAPDH上游引物为5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,下游引物为5′-AAGTGGTCGTTGAGGGAATG-3′，产物长度101 bp。实验重复3次。实验中样本基因的Ct值通过GAPDH的Ct值均一化，即△Ct=Ct样本-Ct内参，样本基因mRNA相对丰度值以 2-△△Ct值表示。

1.2.10蛋白提取与Western blot 实验 将未处理和加ART处理的SK-HEP-1细胞加RIPA裂解液提取总蛋白，等量的细胞总蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转印至PVDF膜。转膜后于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，分别孵育anti-FABP5(1 ∶1 000)，anti-p-PI3K(1 ∶2 000)，anti-PI3K(1 ∶1 000)，anti-p-AKT(1 ∶2 000)，anti-AKT(1 ∶1 000)，anti-β-actin(1 ∶50 000)一抗于4 ℃孵育过夜。隔天洗膜后，室温孵育辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗(1 ∶20 000)1 h。洗膜后采用 ECL发光液成像系统检测。采用ImageJ软件进行图像分析，β-actin为内参。

1.3 统计学处理采用 GraphPad Prism 8.0.1版本进行统计学分析。每一个实验至少经过3次重复验证，使用两样本t检验方法分析比较两组间的差异，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物作用靶点的获取通过PharmMapper数据库得到ART的靶点基因，ART靶点基因299个。根据UniProt数据库查询到的蛋白质，对ART的作用靶点进行注释，筛去UniProt数据库中不包含的作用靶点，最终获得ART的靶点数为282个。

2.2 药物-靶点相互作用网络构建将药物靶点整合后，导入STRING数据库中，限定物种“Homo sapiens”，设置置信度≥0.8，隐藏离散的点，得到162个潜在靶点蛋白，565条相互作用关系。下载PPI信息，将文件导入Cytoscape软件中可视化，得到药物-靶点相互作用网络(图1)。

图1 药物-靶点PPI互作网络

2.3 HCC中关键靶点基因筛选从TCGA下载的HCC数据中提取ART靶点基因的数据，获得278个靶点基因，用R包分析278个靶点基因在HCC中的差异表达水平，筛选出37个差异表达靶点基因(图2A)，上调基因和下调基因(图2B)。接着对37个差异表达基因进行单因素和多因素COX回归分析，单因素筛选出6个差异表达靶点基因，多因素筛选出3个差异表达靶点基因(图2C、D)。

图2 HCC中差异表达基因分析

2.4 FABP5的结合能最高利用Auto Dock Tools软件将ART和对应的3个靶点基因分别进行分子对接。可以看出ART与FABP5 的结合能最大，ART最有可能与FABP5结合(表1，图3)。

图3 分子对接

表1 ART与关键靶点蛋白对接结果

2.5 FABP5在肝细胞癌中更具有预后价值GEPIA2 数据库分析发现LIHC患者中，FABP5在癌组织中的表达量显著高于正常组织且差异有统计学意义(图4A)。MMP12在癌组织中的表达量也高于正常组织但差异无统计学意义(图4B)。TNNC1在正常组织中高表达，但差异无统计学意义(图4C)。GEPIA2数据库预后分析发现FABP5高表达与患者总生存率(overall survival，OS)低显著相关(P=0.001 1)(图4D)。MMP12(P=0.022 0)(图4E)、TNNC1(P=0.009 5)(图4F)高表达与患者OS低也相关，但FABP5更显著。

图4 GEPIA2数据库差异表达和生存分析

2.6 靶点基因通路富集分析将ART的靶点基因通过R语言进行KEGG通路分析，这些基因参与的主要通路包括PI3K/AKT信号通路、脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)通路、前列腺癌(prostate cancer)通路，其中FABP5富集在PI3K/AKT信号通路(图5)。

图5 靶点基因通路富集分析

2.7 ART可能通过FABP5抑制PI3K/AKT信号通路进而抑制肝癌细胞增殖和迁移划痕实验显示，与对照组比较，SK-HEP-1细胞加入ART刺激 48 h后显著抑制细胞迁移(图6A)。MTS实验表明，与对照组比较，ART组能显著抑制细胞增殖(图6B)。qRT-PCR结果显示，与对照组比较，SK-HEP-1细胞加入ART刺激48 h后，FABP5表达水平下降(图6C)。Western blot结果显示，与对照组比较，SK-HEP-1细胞加入ART之后，FABP5的蛋白水平下降；p-PI3K和p-AKT的磷酸化水平下降(图6D)。

图6 ART对肝癌细胞增殖、迁移及对FABP5、p-PI3K、p-AKT表达水平的影响

3 讨论

近年来，虽然靶向药物治疗HCC已经获得了突破性进展，但目前HCC全身治疗药物的效果仍不能让人满意。前期研究[7]发现ART可以通过增强索拉非尼的药物敏感性，从而用于治疗HCC，但ART是否可以治疗HCC以及其潜在靶标和机制仍不明确，需要进一步研究。

基于网络药理学具有对“药物-靶点-疾病”进行网络分析，从而系统找出药物与靶点之间的对应关系，并揭示多种药物协同作用的优势。已有大量研究[10-12]利用生物信息学、网络药理学等方法筛选药物潜在靶点，并将药物与靶点进行分子对接后分析其详细作用机制。本研究借助网络药理学的方法，对ART的潜在靶点进行筛选，共筛选出282个靶点基因，利用Cytoscape软件将靶点基因进行可视化。随后，下载TCGA数据库中HCC测序数据，对靶点基因进行差异表达分析，单-多因素回归分析，筛选出3个关键靶点基因，分别是TNNC1、MMP12、FABP5。有研究[13]表明TNNC1在HCC中高表达，而TNNC1的高表达会促进肝癌细胞迁移。MMP12可能通过增加肿瘤组织中FOXP3+Treg的浸润水平，促进HCC的发生发展及免疫逃避[14]。研究发现，FABP5和多种肿瘤的发生发展密切相关，如FABP5可通过PI3K/AKT信号通路调节肾透明细胞癌细胞增殖[15]，促进肾癌细胞生长和转移[16]，影响肾癌的进展。FABP5可通过调节肺内自然杀伤细胞的成熟控制肺癌细胞转移[17]。FABP5可促进前列腺癌细胞增殖[18-19]。FABP5在肝内胆管癌联合淋巴结转移中显著过表达，并参与体外细胞增殖和侵袭,表明 FABP5可能与肝内胆管癌的进展有关[20]。但是，FABP5在肝癌中却鲜有研究。

利用Auto Dock Tools软件对ART和3个关键靶点分别进行分子对接，结果显示ART和FABP5的结合能最大(-8.77)，说明ART和FABP5蛋白的结合效能最高，提示FABP5可能是ART治疗HCC的潜在作用靶点。利用GEPIA2数据库对3个关键靶点基因在HCC中的表达及预后进行分析，发现只有FABP5具有差异和预后的双重特性，进一步证实FABP5在HCC的发生发展中起着关键作用。通过KEGG通路富集分析发现FABP5主要富集在PI3K/AKT通路，提示ART可能通过调节 PI3K/AKT信号通路影响HCC。细胞实验证实ART可以抑制SK-HEP-1细胞增殖和迁移，ART可能是通过影响FABP5的表达水平，进而影响PI3K/AKT信号通路抑制肝癌细胞的增殖和迁移。

本研究也有局限性。首先，只在细胞水平上进行了验证，没有临床样本进行验证，需要更多前瞻性的真实数据来验证其临床实用性。其次，只证明了ART可能与FABP5结合，但它们结合的机制尚不清楚。

综上所述，筛选出FABP5可能作为ART的作用靶点，FABP5为PI3K/AKT信号通路的上游。ART通过抑制FABP5的表达抑制PI3K/AKT信号通路，进而抑制肝癌细胞的增殖和迁移。HCC中ART与靶点基因之间的内在机制尚不清楚，值得进一步研究。