蓝小河，吴雪辉*，陈嘉慧，陈雪梅，黄永芳，谢克娜

1. 华南农业大学食品学院（广州 510642）；2. 佛山市林业科学研究所（佛山 528000）；3. 华南农业大学 林学与风景园林学院（广州 510642）

金花茶是山茶科山茶属植物，是药食两用植物，在我国广西、云南等地分布，有很高的药用价值[1]。由于金花茶不同部位所含有的主要化学成分不同，其药理活性也不同，而金花茶叶中主要含有皂苷、黄酮和多酚等活性物质，具有良好的降血糖作用[2-3]。苏琳等[4]研究发现，金花茶叶皂苷能调节糖代谢，降低生物体的血糖水平。

皂苷是类固醇或三萜天然糖苷类重要活性成分，广泛存在于人参、三七、黄芪等多种中药材中[5]，可以通过抑制口腔和肠道中α-淀粉酶活性，从而减少碳水化合物的分解和消化，降低生物体的血糖水平，是天然的α-淀粉酶抑制剂[6]。包瑞敏等[7]研究显示黄精总皂苷对α-淀粉酶抑制率达82%，高于糖尿病临床使用的酶抑制剂阿卡波糖，是良好的α-淀粉酶抑制剂。Kamal等[8]通过研究发现摩洛哥坚果皂苷提取物与阿卡波糖相比，具有更好的α-淀粉酶抑制活性，对肝脏的损害更小。

目前，对于皂苷的α-淀粉酶抑制活性的研究主要集中于三七、远志等中药皂苷[9]，而关于金花茶叶皂苷对α-淀粉酶抑制作用的研究鲜见报道，因而该研究以金花茶叶皂苷为原料，探究其对α-淀粉酶的抑制机制及效果，以期为金花茶叶皂苷作为天然α-淀粉酶抑制剂以及金花茶叶资源的开发利用提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金花茶叶（广东省佛山市林业科学研究所金花茶示范林）；α-淀粉酶（美国Sigma-Aldrich公司）；乙醇（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）；可溶性淀粉（天津市科密欧化学试剂有限公司）；3, 5-二硝基水杨酸（纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司）。

DK-8D型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；UV-5200型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 金花茶叶皂苷样品制备

选取无病虫害，无腐烂、枯萎的金花茶叶，于50℃烘干、粉碎，采用60%乙醇溶液提取皂苷，粗提液经LX-213大孔树脂和HP-20大孔树脂纯化分离，蒸发浓缩后干燥得到金花茶叶皂苷样品[10]。

1.2.2 金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制试验

参考范铭[11]的方法，取已配制成一定质量浓度的金花茶叶皂苷溶液、质量浓度为0.5 mg/mL的α-淀粉酶溶液以及缓冲溶液各0.5 mL混合均匀，于37 ℃中恒温水浴10 min后，加入0.5 mL的1%可溶性淀粉溶液继续水浴10 min，最后加0.5 mL的3, 5-二硝基水杨酸显色剂在沸水浴中加热10 min，冷却并稀释一定倍数，置于540 nm处测定吸光度。以缓冲溶液代替α-淀粉酶溶液作为试验空白组、代替皂苷溶液作为对照组、代替皂苷溶液和α-淀粉酶溶液2种溶液作为背景组，按式（1）计算α-淀粉酶的抑制率。

式中：A为试验组吸光度；B为试验空白组吸光度；C为对照组吸光度；D为背景组吸光度。

1.2.3 金花茶叶皂苷质量浓度对α-淀粉酶活性的影响

固定金花茶叶皂苷溶液与α-淀粉酶溶液的反应时间10 min、反应pH 7.0，测定不同质量浓度的皂苷溶液与α-淀粉酶溶液反应后溶液的吸光度，计算抑制率并绘制抑制效果曲线。

1.2.4 金花茶叶皂苷与α-淀粉酶反应pH对α-淀粉酶活性的影响

固定金花茶叶皂苷溶液质量浓度0.5 mg/mL、与α-淀粉酶溶液反应时间10 min，分别测定金花茶叶皂苷溶液与α-淀粉酶溶液在pH为6.0，6.5，7.0，7.5和8.0条件下反应后溶液的吸光度，计算抑制率并绘制抑制效果曲线。

1.2.5 金花茶叶皂苷与α-淀粉酶反应时间对α-淀粉酶活性的影响

固定金花茶叶皂苷溶液质量浓度0.5 mg/mL、反应pH 7.0，分别测定金花茶叶皂苷溶液与α-淀粉酶溶液在反应时间为0，5，10，15和20 min条件下反应后溶液的吸光度，计算抑制率并绘制抑制效果曲线。

1.2.6 金花茶叶皂苷对α-淀粉酶抑制类型的研究

金花茶叶皂苷溶液质量浓度设置为0，0.5和1.0 mg/mL，以1%可溶性淀粉溶液为底物，分别与0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 mg/mL的α-淀粉酶溶液反应10 min，测定反应体系的吸光度变化，以酶质量浓度对反应速率作图。不可逆抑制的速率直线不通过坐标原点，不加抑制剂和可逆性抑制的速率直线均通过坐标原点，且可逆性抑制的速率直线斜率比不加抑制剂的直线斜率小，确定金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制类型为可逆或不可逆。

为了进一步确定金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的具体抑制类型，金花茶叶皂苷溶液质量浓度设置为0，0.5和1.0 mg/mL，分别与0.5%，0.75%，1%，1.25%和1.5%的可溶性淀粉溶液反应，测定反应体系的吸光度变化，作双倒数图。从双倒数图中的直线相交于x轴或y轴可以判断其属于可逆的非竞争性或竞争性抑制，如直线均不相交则为反竞争性抑制，确定金花茶叶皂苷溶液对α-淀粉酶溶液的具体抑制类型[12]。

1.3 数据统计及分析

所有试验重复3次，试验数据均以（x±s）表示，使用Origin 2019软件作图，使用Excel和SPSS软件进行数据分析及处理。

2 结果与分析

2.1 不同金花茶叶皂苷质量浓度对α-淀粉酶活性影响

不同金花茶叶皂苷溶液质量浓度对α-淀粉酶活性影响如图1所示。由图1可知，金花茶叶皂苷对α-淀粉酶具有抑制作用，且皂苷溶液质量浓度与α-淀粉酶抑制率呈一定剂量依赖关系。当金花茶叶皂苷质量浓度从0.5 mg/mL增加到5 mg/mL时，α-淀粉酶的抑制率上升较快；超过5 mg/mL后，随着皂苷质量浓度的增加，α-淀粉酶的抑制率增加减缓；皂苷质量浓度为8 mg/mL时，α-淀粉酶的抑制率达到54.69%，IC50值为7.974 mg/mL。与徐艳阳等[13]研究的黑果腺肋花楸多酚溶液对α-淀粉酶的抑制率随多酚溶液质量浓度变化趋势相似。

图1 金花茶叶皂苷质量浓度对α-淀粉酶抑制作用的影响

2.2 金花茶叶皂苷和α-淀粉酶反应pH对α-淀粉酶活性大小影响

不同反应pH对α-淀粉酶抑制率的影响如图2所示。金花茶叶皂苷溶液对α-淀粉酶溶液的抑制率随着pH的增加先升高后下降。当pH为7.0时，其对α-淀粉酶的抑制率达到最大，此时皂苷对α-淀粉酶的抑制效果最佳，pH继续升高，金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制率逐渐减小。α-淀粉酶在人体肠道中水解碳水化合物，将其分解成适合吸收的单糖，而金花茶叶皂苷抑制α-淀粉酶效果最好时的pH为7.0，与肠道的pH接近[14]，因此可认为金花茶叶皂苷在人体内能够较好地发挥其对α-淀粉酶的抑制作用。

图2 不同反应pH对α-淀粉酶抑制作用的影响

2.3 金花茶叶皂苷和α-淀粉酶反应时间对α-淀粉酶活性大小影响

不同反应时间对α-淀粉酶活性影响如图3所示。由图3可知，随着反应时间的延长，金花茶叶皂苷溶液对α-淀粉酶溶液的抑制率先增加后下降。当反应时间为10 min时，皂苷溶液与α-淀粉酶溶液反应较为完全，α-淀粉酶受到最大程度的抑制；反应时间继续延长，由于皂苷溶液和α-淀粉酶溶液的质量浓度逐渐减小，结合速率降低，皂苷溶液对α-淀粉酶溶液的抑制率逐渐下降[15]，因此可认为反应时间为10 min有利于金花茶叶皂苷发挥其对α-淀粉酶的抑制作用。

图3 不同反应时间对α-淀粉酶抑制作用的影响

2.4 金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制类型

图4为金花茶叶皂苷对α-淀粉酶抑制作用的抑制动力学曲线。如图4所示，不同皂苷溶液质量浓度的3条直线近似穿过坐标原点，加入皂苷溶液后的速率直线斜率较不加皂苷溶液时低，说明金花茶叶皂苷溶液对α-淀粉酶溶液的抑制类型为可逆性抑制[16]。金花茶叶皂苷与α-淀粉酶通过非共价键可逆性结合，从而使α-淀粉酶活性降低或丧失，可以通过透析等方法去除抑制剂后使α-淀粉酶活性得到恢复。

图4 金花茶叶皂苷对α-淀粉酶抑制动力学曲线

图5为金花茶叶皂苷对α-淀粉酶抑制作用的双倒数曲线。由图5可知，不同皂苷溶液质量浓度的3条直线相交且交点位于x轴，说明金花茶叶皂苷溶液对α-淀粉酶溶液的抑制作用不影响酶促反应的米氏常数，不会改变α-淀粉酶对底物的亲和力；加入的皂苷溶液的质量浓度越大，其对应直线的斜率越小，说明金花茶叶皂苷溶液的存在会降低酶促反应的最大反应速度，因此判断金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制类型为可逆的非竞争性抑制[17]。金花茶叶皂苷与α-淀粉酶活性中心以外的基团结合，底物质量浓度不影响皂苷对α-淀粉酶的抑制作用，抑制过程取决于抑制剂的质量浓度，与刘雪辉[18]研究发现武靴藤中皂苷类化合物对α-淀粉酶抑制的作用机制一致。

图5 金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的双倒数曲线

3 结论

通过金花茶叶皂苷对α-淀粉酶抑制活性的抑制作用条件以及抑制类型进行探究，试验发现金花茶叶皂苷对α-淀粉酶有一定抑制作用，且抑制效果与皂苷质量浓度呈一定剂量依赖关系，当pH为7.0、反应时间为10 min时，皂苷抑制α-淀粉酶活性的效果最佳，此条件下皂苷质量浓度为8 mg/mL时，金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制率可达54.69%，IC50值为7.974 mg/mL，金花茶叶皂苷对α-淀粉酶的抑制类型为可逆的非竞争性抑制，研究结果可为金花茶叶皂苷在α-淀粉酶抑制剂领域的开发利用提供一定参考。