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昆仑雪菊中总黄酮的提取及其对肿瘤细胞活性研究

2017-02-05刘苑星

科技经济市场 2016年5期
关键词:总黄酮抑制率

刘苑星

摘要:采用乙醇回流提取法提取昆仑雪菊中的总黄酮物质,选取大孔树脂分离纯化昆仑雪菊中的总黄酮,用芦丁标准品制标准曲线检测总黄酮含量,回归方程为A=15.508C-0.0044,R2=0.9995。乙醇回流提取液中总黄酮含量为9.04%。通过MTT法测定黄酮对肿瘤细胞增殖的影响,记录统计实验数据,抑制率=1-(实验组A值一空白组A值)/(对照NA值一空白组A值)。抑制率≥30%判定药物敏感试验为阳性,抑制率≤30%判定药物敏感试验为阴性。

关键词:昆仑雪菊;总黄酮;肿瘤细胞;抑制率

前言

昆仑雪菊为新疆特有植物,学名双色金鸡菊,属菊科金鸡菊一年生草本植物,是具有降血压、降血脂等独特功效的稀有高寒植物,具有极高的药用价值。昆仑雪菊中的总黄酮含量高达12%,远超其他菊类。其富含的总黄酮具有多方面功效。其中,黄酮作为一种较强的抗氧化剂,其抗氧化能力是维生素E的10倍以上,可有效增强生物对病原体的抵抗能力,清除体内的氧自由基,从而起到阻止细胞衰老、癌变的作用。因此昆仑雪菊中富含的总黄酮具有免疫调节的功能,是调节血糖、降低血压血脂、抗衰老及癌变等有关药物中重要的物质。

目前,对于昆仑雪菊的植物分类学生物生态学特性等方面,国内外的研究开发报道较多,除此之外对其研究甚少,尤其是药理学方面,仅见其降血压、降血脂、抗氧化、微循环及抗凝血作用的研究。有关昆仑雪菊对肿瘤细胞影响的研究,目前鲜见报道。为进一步探讨昆仑雪菊中黄酮物质的抗肿瘤活性研究,首先从昆仑雪菊中提取总黄酮,进一步研究昆仑雪菊中总黄酮对肿瘤细胞增殖抑制作用,不仅为开发和综合利用昆仑雪菊资源提供一定的理论依据,更为中药治疗肿瘤疾病的新药奠定理论与实践基础。

1药物与仪器

昆仑雪菊(2015年10月采自新疆和田地区昆仑山区),紫外可见分光光度计,电子天平,电热恒温水浴锅,水循环真空泵,旋转蒸发器,芦丁标准品,亚硝酸钠,硝酸铝,乙醇,氢氧化钠等均为AR级。

2实验方法

2.1分离提取昆仑雪菊中的黄酮

乙醇回流提取液:用适量体积分数95%的乙醇浸泡昆仑雪菊粉末48h,将抽滤所得液体在温度45℃条件下,用旋转蒸发仪蒸发4h,提取液转移到250ml容量瓶中,并定容到刻度,再取10ml溶液置50ml容量瓶中定容至刻度液。

2.2昆仑雪菊提取液的纯化

取15g大孔树脂,用95%乙醇浸泡24h。取10g大孔树脂装柱,用95%乙醇冲洗,冲洗至冲洗液与蒸馏水以1:4混合不显白色浑浊为止。将冲洗好的大孔树脂倒入昆仑雪菊粗提物中,摇床震荡24h。将震荡好的粗提物进行抽滤,上层固体用95%乙醇浸泡24h,下层液体密封冷藏备用。次日将浸泡好的固体进行抽滤,抽滤所得下层液体在45℃条件下旋蒸1.5h,所得粘稠液体经称量为9.13g,冷藏备用。测得总黄酮含量为68.04%。

2.3芦丁标准溶液的制备

(一)对照品溶液的制备

精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品50mg,置于50mL容量瓶中,加甲醇35mL,置水浴上微热使其溶解,放冷,加甲醇至刻度,摇匀。精密吸取5mL,置于50mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀,即得(每1mL中含有无水芦丁0.1mg)。

(二)标准曲线的制备

分别按照0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml浓度梯度量取对照品溶液(0.1mg/ml),并置于10ml容量瓶,各加30%乙醇使成5.0ml,各精密加入5%亚硝酸钠溶液0.3ml,充分摇匀,放置8分钟。各精密加入10%硝酸铝溶液0.3ml,充分摇匀,放置8分钟。各加lmol/L氢氧化钠溶液4.0ml,用蒸馏水稀释至刻度,充分摇匀,放置16分钟,用分光光度计,在510nm波长处测定其吸光度。分别以浓度、吸光度为横、纵坐标,绘制标准曲线图。

2.4提取液中总黄酮含量的测定

量取不同提取液100ml置于25ml容量瓶,加水至6ml,以相应溶液为空白对照组,根据以上方法配制样品溶液,在510nm波长处测定A值。代入回归方程后得出结果,见表1。

2.5 MTT法测定黄酮对肿瘤细胞活性的影响

采用MTT法检测样品对MCF7细胞增殖的抑制作用。将MCF7细胞分别以3x104个/ml接种于96孔培养板中,加入培养液,在37℃饱和湿度、5%C02条件下孵育24h,24h后观察细胞贴壁的情况。取出每孔的培养液,按照梯度浓度0、25、50、100、200、400、600μg/ml向每组各孔中加入昆仑雪菊提取液的培养溶液,同时向对照组加入相同浓度得DMSO,阳性对照组每组为4个孔,向每孔加入顺铂(20g/μl),在37℃饱和湿度、5%C02条件下孵育48、72、96h,在培养结束4h前,向每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl,继续培养4h,吸去孔中的上清液,向每孔加入DMS0150μl,置于摇床上低速振荡,在结晶物充分溶解后,用DNM-9602G型酶联免疫检测仪(OD510nm)测每孔的吸光度值,由公式可得细胞增值抑制率,抑制率=1-(实验组A值一空白组A值)/(对照组A值一空白组A值),抑制率≥30%判定药物敏感试验为阳性,抑制率≤30%判定药物敏感试验为阴性。

3结果与分析

按照浓度梯度0、25、50、100、200、400、600μg/ml,将不同浓度的昆仑雪菊提取液作用于MCF7细胞,孵育72h后,观察不同浓度的昆仑雪菊提取液样品对MCF7细胞增殖的影响,并记录数据。由表2知,昆仑雪菊总黄酮粗提物对MCF7细胞有抑制作用,其IC50为372.59μg/ml,增大浓度,细胞增殖的抑制率也随之增大,因此昆仑雪菊总黄酮粗提物对MCF7细胞生长抑制影响呈剂量依赖性。通过与提取物的IC50比较,昆仑雪菊总黄酮的纯化物对MCF7细胞增值具有抑制作用。

4结论与讨论

由于目前主流的治疗癌症方法的缺陷很大,因此国内外科学家们开始将研究抗肿瘤药物的目光移至天然产物上,其中包括从中草药中提取抗肿瘤活性强的物质。本研究中,用乙醇回流提取法提取昆仑雪菊黄酮类化合物。利用可见紫外分光光度法对昆仑雪菊药材中总黄酮的含量进行测定。选用芦丁为对照品,选择测定波长510nm,制作标准曲线和回归方程,再通过样品吸收度值计算含量结果发现,昆雪菊总黄酮在浓度为0.01~0.08mg/mmL的范围内具有良好的线性关系。

该研究采用MTT法检测昆仑雪菊总黄酮粗提取物对细胞增殖的影响。由最终结果可得,昆仑雪菊总黄酮粗提物对MCF7细胞增值具有抑制作用。活细胞比例随样品浓度加大逐渐减少,细胞凋亡发生率明显上升。综上,昆仑雪菊总黄酮纯化物对MCF7细胞有很好的抑制作用,其机制可能与其诱导细胞有关。

本课题研究昆仑雪菊中总黄酮对肿瘤细胞活性抑制作用,在以后的研究中,还应就具体增值抑制作用机理展开具体研究。

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