徐青青 陈文韬 江银波 蓝银苑 潘钰莹曾丽红 杨建江 薛耀华 郑和平，2

1安徽医科大学广东皮肤病临床学院（合肥 230032）；2广东省皮肤病医院（广州 510091）；3南方医科大学皮肤病医院（广州 510091）

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是世界范围内最常见的性传播疾病病原体［1］，全球每年新发Ct 感染病例约1.27 亿［2］，主要引起男性尿道炎、附睾炎、前列腺炎和女性宫颈炎、盆腔炎、异位妊娠、流产、死胎等［3-4］。生殖道Ct 感染不仅是临床常见的性传播疾病，还是人类乳头瘤病毒致宫颈癌的协同因子［5］，以及人类免疫缺陷病毒感染的重要协同因素，严重威胁人类生殖健康［1，6］。

Ct 是专性细胞内寄生的原核细胞微生物，具有独特的双相发育周期，胞外具有感染性的原体和胞内代谢活跃的始体，在48 ～72 h 的生命周期内原体和始体互相转换，最终实现自身的增殖与播散［7］。沙眼衣原体主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）是存在于原体和始体外膜上的多功能蛋白，占外膜总蛋白的60%［8］，与沙眼衣原体抗原性、结构稳定性、生长代谢调节和毒力密切相关。MOMP 由5 个保守区夹着4 个可变区（variable domains，VD）组成，基于VD 段中抗原决定簇的差异，Ct 分为（A，B，Ba，C，D，E，F，G，H，I，G，K，L1，L2，L3）15 个血清型［9］。此外VD 内包含多个具有免疫原性的T、B 细胞表位，可作为重要的免疫原刺激机体免疫应答［10］，因而MOMP 是目前Ct 疫苗研究的潜在候选抗原［11］。同时MOMP 作为外膜上的孔蛋白，其结构中的二硫键在维持原体刚性外膜的结构完整性中具有重要作用［12］。有研究报道MOMP 与Ct 感染宿主细胞初期的黏附作用有关，通过促进与宿主细胞的非特异性（静电和疏水）相互作用来发挥粘附素的功能［10，13］。MOMP作为Ct 疫苗及Ct 致病机制研究的重要抗原，抗MOMP 抗体成为实验研究的必要工具，然而，目前与多种血清型Ct 结合的商品化抗体依赖进口，因此本研究设计合成了1 条13 肽，并与钥孔帽血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶联，通过免疫新西兰兔成功制备出MOMP 多克隆抗体，为后续更深入地研究MOMP 的生物学功能提供了有力工具。

1 材料与方法

1.1 材料 沙眼衣原体A，B，Ba，C，D，E，F，L1 型标准株和Hela 细胞由广东省皮肤病医院实验室保存；雄性新西兰兔购自广州市花都区花东信华实验动物养殖场，许可证号为：SCXK（粤）2019-0023，饲养于华南农业大学实验动物中心，本实验经华南农业大学实验动物伦理委员会审查通过（伦理审查编号为：2020c004）；弗氏佐剂购自上海Beyotime/碧云天公司；辣根过氧化物酶底物购自美国密理博公司；细胞培养板购自广州洁特公司；驴抗兔抗体和衣原体MOMP 抗体购自美国Abcam 公司；酶标仪购自Thermo Fisher 公司；激光共聚焦显微镜购自尼康公司；蛋白电泳仪购自Bio-Rad 公司；二氧化碳细胞培养箱购自Thermo Fisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 多肽抗原的设计和合成 通过对比15 个血清型Ct 标准株的氨基酸序列设计出13 肽DTTTLNPTIAGAG 作为抗原，同时选定9 肽TTLNPTIAG作为后期抗体效价检测的抗原［11］。多肽的合成和偶联血蓝蛋白委托吉尔生化（上海）有限公司完成，利用反向高效液相色谱法测定多肽纯度，MS 质谱测定合成肽段的分子量，得到9 mg 免疫原KLH-Cys-DTTTLNPTIAGAG，3 mg 检测抗原BSACys-TTLNPTIAG。

1.2.2 抗体的制备 免疫前采集兔血清做对照，取多肽与等体积弗氏完全佐剂充分乳化，对新西兰兔进行两侧腹股沟和腋窝皮下注射，剂量为400 μg/只。四周后使用不完全佐剂乳化多肽进行加强免疫，一周后静脉取血，经ELISA 检测效价达到预期后心脏取血，血清置-70 ℃保存。

1.2.3 抗体效价的测定 将9 肽抗原稀释并包被酶标板过夜，将血清从1∶100 开始2 倍梯度稀释至1∶51 200，并设置阴性血清对照，孵育和显色后在450 nm 波长处测量吸光度值，可检测到阳性信号的最低稀释倍数即为待测抗体效价。

1.2.4 纯化血清 兔血清经0.22 μm滤膜过滤后加入Protein A/G 纯化柱，对纯化前后血清进行SDSPAGE 电泳，考马斯亮蓝染色并使用Image J 分析灰度值。

1.2.5 Ct 培养 Hela 细胞 以1 × 105个/孔接种于24 孔细胞板中，次日向孔内加入Ct 悬液（约1 ×105IFU/孔），室温1 500 r/min 离心60 min，5% CO2细胞培养箱培养至48 h。

1.2.6 Western blot Ct 感染48 h 后收集细胞，采用10%的分离胶进行电泳，转膜后于室温封闭1 h；TBST 稀释纯化后的血清作为一抗，室温孵育1 h；HRP 标记的羊抗兔IgG 孵育1 h，曝光显影。

1.2.7 免疫荧光染色 Ct 感染细胞48 h 后，4%多聚甲醛溶液固定15 min；加入5%牛血清白蛋白封闭30 min；加入纯化后血清4 ℃孵育过夜；FITC 标记或TRITC 标记的驴抗兔二抗孵育60 min；或FITC标记的商品化抗体染色；含DAPI 的防荧光淬灭油封片，激光共聚焦显微镜观察荧光信号并拍摄图像。

2 结果

2.1 多肽抗原的纯度及分子量检测 经RP-HPLC检测多肽的纯度为96.7%（图1A），合成多肽的相对分子质量为1.33 kDa（图1B）。

图1 多肽的纯度及分子量检测Fig.1 Determination of purity and molecular weight of polypeptide

2.2 SDS-PAGE 检测IgG 抗体纯度 免疫兔血清经Protein A/G 抗体纯化柱纯化，SDS-PAGE 电泳后经考马斯亮蓝染色检测IgG 抗体纯度（图2），经分析计算E4、E5 的抗体纯度分别为89.6%、86.68%，表明已纯化出兔IgG 抗体。

图2 SDS-PAGE 检测IgG 抗体纯度Fig.2 Detection of the purity of IgG antibody by SDS-PAGE

2.3 间接ELISA 测定抗体效价 间接ELISA 检测免疫前血清、免疫血清及纯化抗体的效价，纯化前的兔血清效价达到1：6 400，纯化后抗体效价达到1∶12 800（图3），效价较高。

图3 间接ELISA 检测抗体效价Fig.3 Detection of antibody titer by indirect ELISA

2.4 Western blot 检测抗体特异性 Western blot结果显示不同血清型Ct 均可与MOMP 多克隆抗体反应，在相对分子质量约40 kDa 处均可见条带（图4），由于不同血清型MOMP 分子量大小存在差异，条带位置略有不同。

图4 Western blot 检测MOMP 抗体的特异性Fig.4 Detection of the specificity of MOMP antibody by Western blot

2.5 免疫荧光检测抗体特异性 不同血清型Ct 感染细胞均可见核旁苹果绿色荧光团块，与MOMP 在细胞内分布一致（图5）。由于不同血清型Ct 生命周期不完全一致，感染48 h 时成熟度不同，各型别间荧光强度略有差异。免疫荧光结果表明MOMP抗体能够识别不同血清型Ct，具有较好的反应性和特异性。

图5 间接免疫荧光染色检测MOMP 抗体的特异性Fig.5 Detection of the specificity of MOMP antibody by indirect

2.6 比较MOMP抗体与商品化抗体作用效果 对Ct 感染的Hela 细胞进行MOMP 抗体与商品化抗体混合染色，可见Ct MOMP 多克隆抗体染色后红色荧光广泛分布于Ct 膜表面（图6），与商品化抗体的绿色荧光发生明显的共定位，荧光强度相当。

图6 MOMP 抗体与商品化抗体免疫荧光染色作用效果Fig.6 The functional comparison of MOMP antibody and commercial antibody by immunofluorescence staining

3 讨论

Ct 目前已鉴定出15 个血清型，其中A-C 型常引起沙眼，D-K 型易引起泌尿生殖道感染，L1-L3型常造成性病淋巴肉芽肿［9］。MOMP 包含Ct 血清型抗原决定簇，不仅是Ct 血清型分型的基础，还与Ct 毒力、结构稳定性及免疫防御密切相关。目前国外商品化MOMP 抗体价格昂贵，国内研究以A、E、L2 型MOMP 蛋白为抗原免疫动物获得相关抗体，但所制备的抗体并未对其他血清型Ct 进行鉴定［14］，因此本研究制备能与多种血清型Ct 结合的MOMP 多克隆抗体，为Ct 疫苗及Ct 致病机制研究奠定基础。

目前以特异性抗原免疫动物制备相应的多克隆抗血清是免疫学研究的常用方法，但大肠杆菌原核表达系统纯化表达蛋白或肽段抗原存在实验周期长、蛋白溶解度差、产量少和纯度低等问题［15］。随着生物信息学的迅速发展和高通量筛查技术在抗原表位预测中的普遍应用，人工合成多肽作为抗原的潜力逐渐受到关注［16］，制备的抗体既保持序列特异性，又因其生产成本低、标准化高、特异性好和安全性强等特点，广泛应用于病毒［17］、细菌［18］、寄生虫［19］和癌症［20］等领域相关抗体制备。本研究在分析MOMP 序列的基础上设计合成1 条13 肽抗原，既缩短了构建载体和纯化蛋白的时间，又提高了抗原的纯度。由于肽段分子量小，免疫原性不强，可能在体内降解而不能诱导动物产生抗体，为了解决多肽抗原稳定性和免疫原性问题，笔者在设计多肽时在N 端添加一个半胱氨酸与血蓝蛋白偶联。由于载体蛋白自身也能引发免疫反应，抗血清中会产生针对KLH 的抗体［21］，因此在间接ELISA 试验中采用BSA 与多肽偶联作为包被原，排除血清中针对KLH 抗体的干扰。

本研究制备的兔多克隆抗体ELISA 效价达1∶12 800，显示MOMP 抗体具有良好的反应性。Western blot 和免疫荧光试验证实其对8 个血清型Ct（A，B，Ba，C，D，E，F，L1）均具有良好的结合能力，且与进口商品化抗体发生明显共定位，荧光强度相近、效果相当。进口MOMP 抗体价格昂贵且货期长，本研究MOMP 多克隆抗体易于制备，经济实惠。MOMP 抗体可用于免疫荧光染色、免疫印迹、免疫组化等实验，为后续MOMP 蛋白的功能及作用机制研究提供有效的工具。

本研究证实MOMP 抗体能与8 个血清型Ct 发生特异性结合，这8 个血清型Ct 可导致沙眼、生殖道感染和性病淋巴肉芽肿，但仍有几个血清型Ct尚未进行Western blot 和免疫荧光试验，MOMP 抗体能否与所有血清型Ct 特异性结合，还需要进一步实验验证。

综上所述，本研究成功制备出效价高、特异性好的多克隆抗体，能与多种血清型Ct 结合，为后续进一步研究MOMP 蛋白的功能及作用机制奠定实验基础。