林事成,刘殿娜,庄垚雪,梁天宇,王潇凡,胡凯文,李泉旺

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，中国的发病率和病死率均排在第一[1]，由于早期的肺癌症状不明显，多数病人发现时就已经是晚期，无法进行手术根治。冷冻消融是新兴的肿瘤微创治疗手段，安全有效，不良事件发生率低。已在前列腺癌、肺癌、肝癌等多种实体肿瘤上取得良好临床治疗效果。冷冻消融治疗过程中，在最大限度消灭肿瘤的同时又要保护正常组织，很难保证所有癌组织都能达到致死温度，将会形成一圈亚致死区。冷冻消融后残存肿瘤细胞及肿瘤微环境与肿瘤的复发、转移密切相关。冷冻消融后对残留肿瘤细胞存在的后续杀伤作用及其具体机制尚不明确。该课题将利用细胞实验和动物实验验证冷冻消融对肺癌细胞凋亡的影响，并初步探索其作用机制，以期为冷冻消融的临床应用提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料人肺癌H1299细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)；小鼠肺癌Lewis细胞株(江苏凯基生物技术股份有限公司)；SPF级雄性C57BL/6小鼠共8只(北京斯贝福生物技术有限公司)，6周龄，体质量(20±2)g，许可证号：SCXK(京)2019-0010；氩氦刀冷冻治疗系统及1.2 mm冷冻刀头(美国Endocare公司)；RPMI-1640培养基、DMEM高糖培养基(美国Hyclon公司)；胎牛血清(美国Merck公司)；Annexin V-Fitc/PI双染试剂盒(江苏凯基生物公司)；Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(美国Thermo Fisher公司)；SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒(苏州近岸蛋白公司)；Bax及Bcl-2多克隆抗体及山羊抗兔(鼠) IgG二抗(武汉Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 RPMI-1640完全培养基(RPMI-1640+10 %胎牛血清+1 %双抗)培养H1299细胞，DMEM高糖培养基(DMEM高糖+10 %胎牛血清+1 %双抗)培养Lewis细胞，均置于恒温细胞孵育箱中培养，待细胞生长至70%时进行传代，约2～3 d传代1次。……