孙浩男， 李 蓉， 李明阳， 郑 妍， 刘志杰， 张存石， 刘冬云，李 鹤

(河北农业大学园林与旅游学院， 河北 保定 071000)

金鸡菊是菊科(Compositae)金鸡菊属(Coreopsis)植物的统称，全属约80多种，主要原产于北美洲和南美洲，我国在上个世纪就有引种部分金鸡菊的记录，中国植物志共记录7种[1-2]。金鸡菊种类繁多，适应性强，观赏价值高，多用于盆栽、花园及道路景观等，是出色的花卉资源。在我国，两色金鸡菊(C.tinctoria)也被称作‘雪菊’，其干燥的头状花序也可泡茶饮用，具有一定的药用价值和经济价值[3-4]，在我国栽培范围较广。目前，国内外学者对金鸡菊野生资源的研究集中在系统发育、分类和资源调查上；对于栽培资源，主要集中在栽培繁殖、抗逆性、药理和花期调控方面的研究[5-10]；栽培金鸡菊品种繁多，育种背景复杂，其中涉及大量的种间杂交，此外，市场上的部分资源更是来历不明，存在同物异名的现象，极大影响了栽培金鸡菊的应用和推广，急需对其开展分类鉴定和遗传多样性研究。

前人常用形态标记、细胞学标记和同工酶标记等手段对金鸡菊属进行遗传多样性研究。Jansen等人[11]发现，金鸡菊属在形态上具有丰富的遗传多样性，利用种子、叶子及花部等32个性状可对11组的种进行一定划分；2019年，国际植物新品种保护联盟公布了44个描述金鸡菊新品种的重要指标，而叶子和花部是其主要变异部位，也是栽培金鸡菊主要的观赏性状[12]；Smith[13]经过统计发现，野生金鸡菊的染色体基数包括x=6，7，8，9，10，12，13，14等多种类型，倍性主要为二倍体和四倍体；而孙浩男等[14]发现，栽培金鸡菊的染色体数目为20～60不等，十分多变，籽播系的栽培金鸡菊主要为二倍体，而无性系的的栽培金鸡菊中含有大量的异源多倍体和非整倍体。1995年，Mesfin等[15]首次报导了原产于北美的金鸡菊的花粉形态，其在花粉粒大小和脊柱长等方面具有丰富的遗传多样性。此外，同工酶标记也有说明了金鸡菊属具有丰富的遗传多样性[16-17]。

目前，用于研究金鸡菊属植物研究的分子标记较少。Czarnecki[18]利用AFLP标记对美国佛罗里达州的11个莱氏金鸡菊(C.leavenworthii)野生居群进行研究，发现其遗传多样性主要集中在居群间。梁玉[19]通过RAPD标记分析得出，入侵我国山东地区的大花金鸡菊(C.grandiflora)在居群内表现的遗传多样性要大于居群间。Smith[20]筛选了10对SSR引物用于评估莱氏金鸡菊在人工生产种子阶段发生的遗传漂变和遗传流失，认为分子标记相比形态标记能够更早地揭示其遗传分化。樊丛照等[21]利用ISSR标记研究我国栽培的两色金鸡菊种质，发现其明显存在地域性的遗传分化。长期以来，也有众多分类学家利用EST、ITS、rpl16、matK等序列用于金鸡菊物种的分类和鉴定[22-23]。但这些试验的研究对象主要为原产于北美的野生种和我国部分归化的栽培种，较少涉及其它具有复杂遗传背景的栽培金鸡菊。

简单重复序列标记(Simple Sequence Repeat)简称SSR，是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，SSR具有易于操作、重复性好、共显性的特点，适用于植物鉴定与遗传多样性的研究，其可分为g-SSR和EST-SSR两类，而后者开发成本低，周期短，在同属植物中具有较好的通用性[24]。目前，我国栽培最为广泛的金鸡菊种质为剑叶金鸡菊(C.lanceolata)、大花金鸡菊和两色金鸡菊等相关种质。剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’是剑叶金鸡菊和大花金鸡菊的种间杂交品种，具有花朵硕大、花色奇特且株型紧凑等优点。本研究以剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’的叶片进行转录组测序，分析其SSR位点分布频率和特点，以此开发新的EST-SSR引物，并对课题组收集自国内外的100个金鸡菊种质进行遗传多样性和亲缘关系分析，旨在为栽培金鸡菊从分子角度上进行分类划分，同时为金鸡菊种质的鉴定、杂交育种及指纹图谱的构建等方面提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 转录组数据来源

转录组测序样本采自剑叶金鸡菊品种‘斯丹泰勒’，采样时选取10片真叶期幼苗的所有叶片，设置3个重复，将叶片擦拭洁净后交至北京诺禾致源科技公司进行Illumina 2代高通量无参转录组测序，通过Trinity拼接得到共42 958条Unigene。

1.2 转录组EST-SSR位点鉴别及SSR引物设计

采用MISA(1.0版，默认参数)进行EST-SSR位点检测；利用Primer 3(2.3.5版，默认参数)进行引物设计；使用DNAMAN 8对正、反向引物进行检测筛选，避免出现DNA颈环、引物二聚体等，最后从中随机挑选50对SSR引物，分别利用6个亲缘关系较远的材料(金鬃-中国、‘雪菊’、大花-美国、玫红-德国、三叶金鸡菊和沙漠金鸡菊)进行退火梯度试验和多态性验证试验，筛选出合适的引物。引物由Thermo Fisher公司合成。

1.3 试验材料及种植条件

植物材料为课题组收集的金鸡菊种质资源共100个(表1)，包括国内外广为栽培的原生种和栽培品种等97个，课题组自选育3个。

表1 供试的100个金鸡菊种质的信息Table 1 Information of 100 tested Coreopsis germplasms

续表1

续表1

2019年4月下旬在日光温室内对材料进行播种和扦插。籽播系材料使用128穴盘播种，基质为进口草炭、珍珠岩、蛭石比例8∶1∶1。无性系材料使用50深穴盘扦插，扦条选用枝条顶部2节嫩芽，插入基质为进口草炭、珍珠岩4∶1。6月上旬挑选根系饱满的穴盘苗移栽于2加仑规格的花盆中，基质为国产草炭、椰糠、珍珠岩比例5∶1∶1，每种材料30株。9月上旬播种一年生材料，10月中旬上盆，方法同上。所有上盆材料每隔3个月施用1次奥绿1号缓释肥，每次12 g。所有植物统一使用滴灌浇水，花后及时修剪保证复花，冷棚内过冬，统一修剪枯枝，2020年4月下旬统一移出室外。

1.4 DNA提取、PCR扩增与数据统计

2020年8月初统一采集植株叶片，植物基因组DNA试剂盒购买自康为世纪公司，具体步骤按说明书进行。使用Nano Drop 2000微量分光光度计检测提取的金鸡菊DNA浓度，并用1.5%琼脂糖凝胶(1×TAE缓冲液，120 V，0.5 h)对DNA母液上样检测，最后使用灭菌去离子水将各材料的DNA母液稀释至30 ng·μL-1备用。

使用20 μL PCR扩增反应体系：2×Es Taq Master Mix(康为世纪生物科技有限公司)10 μL；正、反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 6 μL。

PCR反应程序：94oC预变性4 min；94℃变性30 s，退火(最适退火温度下)30 s，72℃延伸30 s，32个循环，5 min终延伸，12℃保存。扩增产物使用8%非变形聚丙烯酰胺凝胶进行检测，220 V电压下电泳2.5 h，银染后显色、定影并进行拍照。

电泳图上清晰条带记为“1”，同位置无条带或不易分辨的弱带记为“0”，以此建立原始数据矩阵。计算各引物的扩增总带数(Total amplified bands，TB)、多态性带数(Number of polymorphic bands，PB)和多态性条带百分比(Percentage of polymorphic bands，PPB)。使用NTsys 2.10e软件，绘制UPMGA聚类图。利用Popgene 32软件计算各材料间的遗传相似系数(Genetic similarity，GS)和遗传距离(Genetic distance，GD)。

2 结果与分析

2.1 转录组中SSR位点的数量与分布

根据测序结果，对41 634 448 bp的转录组数据进行SSR检测(表2和表3)，从5 470条序列中(占总数12.73%)共搜索出SSR位点6 546个，其中850条序列含有至少一条SSR位点，占总数的1.98%，431条序列具有复合型SSR位点，占总数的1.00%，平均6.36 kb基因具有一个SSR位点。

表2 剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’转录组中检测到的EST-SSR的基本信息统计Table 2 The statistic of EST-SSR in transcriptome of Coreopsis lanceolata ‘Sterntaler’

2.2 转录组SSR基序重复类型和频率特征

SSR位点类型较为丰富(表3)，共包含117个种类，其中单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸数量较多，占比分别为46.80%，19.28%和30.13%，四核苷酸和六核苷酸占比极少，分别为1.80%和1.15%，五核苷酸占比最少，仅占0.77%。六核苷酸的重复类型最多，有53种，其次为五核苷酸和四核苷酸，分别为27种和21种。除单核苷酸外，二核苷酸的重复次数以6次和7次为主，三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸的重复次数以5次和6次为主，而六核苷酸内，重复次数为5的种类远大于其它种类。

表3 剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’转录组中EST-SSR位点类型、数量及分布频率Table 3 Type,number and frequency of EST-SSR in transcriptome of Coreopsis lanceolata ‘Sterntaler’

在检测的重复单元类型上(表4)，二核苷酸中占比最多的是AG/CT(57.30%)，最少的是CG/CG(0.48%)；三核苷酸中占比较多的是AAT/ATT(27.94%)、ACC/GGT(21.75 %)，ATG/ATG(18.26%)，AAG/CTT(12.22%)；四核苷酸中占比最多的是AAAG/CTTT(16.10%)，其次为AAAT/ATTT(13.56%)，ACAT/ATGT(12.71%)；五核苷酸和六核苷酸中占比最多的分别为AAAAC/GTTTT(16.07%)和ACCGCC/CGGTGG(5.33%)。重复次数介于5～70次，以5～10次为主，占总数的67.93%。

表4 剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’转录组中EST-SSR基序的分布Table 4 Distribution of EST-SSR motif in transcriptome of Coreopsis lanceolata ‘Sterntaler’

2.3 EST-SSR引物设计与筛选

去除掉复合型SSR位点，在6 115条包含SSR的序列中设计得到4 499条对EST-SSR引物，从中随机挑选50对引物进行扩增，其中22对引物的扩增效果较好。根据表5，22对引物的重复基元由二核苷酸至六核苷酸不等，退火温度在56～64℃，最低的是Core04和Core12，最高的是Core08和Core16。22对引物共扩增出清晰的条带166条，全部为多态性条带，多态性条带数百分比为100%，每条引物的扩增条带3～14个，平均扩增条带7.55个，其中Core04和Core24最多(图1)，而Core16的最少。

图1 EST-SSR引物Core04和Core24部分PCR扩增电泳图谱Fig.1 Partial PCR amplification electrophoresis of EST-SSR primers Core04 and Core24

表5 金鸡菊EST-SSR引物的序列和扩增情况Table 5 Sequence of EST-SSR primers and their amplification of Coreopsis

2.4 亲缘关系分析

根据22对EST-SSR引物的扩增结果，100个栽培金鸡菊种质的遗传相似系数介于0.542 2～1，平均为0.747 6。四个Lemonade系列的材料：‘热带柠檬汁’‘粉色柠檬汁’‘草莓柠檬汁’和‘樱桃柠檬汁’彼此之间的遗传相似系数均为1，‘日落梦想’和‘粉色梦想’也为1，而‘帝国阳光’和大花金鸡菊之间具有最小的遗传相似系数0.542 2。

遗传距离介于0～0.947 0，平均为0.327 5。四个Lemonade系列材料之间的遗传距离最小，而‘日落梦想’和‘粉色梦想’两者之间也为0，亲缘关系较近。有19组材料的遗传距离为0.947 0，如大花金鸡菊的两个品种‘日出’与‘阳光’、大花金鸡菊‘朝阳’与剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’、同为Hardy Jewel系列的‘黄水晶’与‘红宝石霜’、不同系列的‘菠萝派’与‘日落梦想’、两色-美国矮和‘不可思议矮’等。

2.5 聚类分析

根据UPGMA聚类结果(图2)，在L1(D=0.460)处，100个金鸡菊种质可划分为七类，每一类大体由一定的原生种和相关种质组成，并与金鸡菊属下的分组有关：第Ⅰ类由大花金鸡菊、剑叶金鸡菊等金鸡菊组下的原生种和以该组为主要亲本的各品种组成；第Ⅱ类主要包括两色组的两色金鸡菊、莱氏金鸡菊及歧序组的玫红金鸡菊等原生种、品种和以它们为主要亲本的品种；第Ⅲ类的包含11个金鸡菊种质，主要包括轮叶金鸡菊及其相关品种等；第Ⅴ类仅含有两个原生种：大叶金鸡菊和掌叶金鸡菊，两者和轮叶金鸡菊同属轮叶组；而三叶金鸡菊(轮叶组)、皇冠金鸡菊(金鸡菊组)及沙漠金鸡菊(异果组)则分别独成一组。在L2(D=0.610)处，可进一步划分为18个小组，几乎能将所有原生种区别开。

图2 供试的100个金鸡菊种质资源的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA clustering map of 100 tested Coreopsis

3 讨论

EST-SSR所在的基因转录区相对保守，在同属内的植物中具有较好的通用性，虽然也可移植已发表的SSR引物用于同科不同属，或同属不同族植物，但引物的通用性一般较差，而且耗时耗力[25-26]。本试验也测试了Smith根据莱氏金鸡菊开发的10对SSR引物[22]，但通用性和多态性较不理想。根据本次转录组的数据分析，剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’的SSR位点类型丰富，以三核苷酸重复类型为主，不同于亚洲莲[24]的二核苷酸和红豆杉[27]的六核苷酸，其占比最多的类型在同科植物上也存在很大不同[28-29]；平均6.36 kb包含一个SSR位点，高于万寿菊(2.15 kb)[28]，与赛菊芋(6.79 kb)[29]较为接近。这些差异可能与物种和SSR位点搜索的标准不同有关，但也可能是采样部位、发育时期等不同导致的。

栽培金鸡菊大多源于远缘杂交，具有复杂和丰富的遗传背景[30]，孙浩男等[14]认为，栽培金鸡菊的主要亲本具有复杂的染色体基数和染色体倍性，由此导致栽培金鸡菊中存在大量以二倍体、三倍体和四倍体为基础的非整倍体和异源多倍体。电泳图谱和条带统计显示，本次开发的22对引物均有较好的扩增效果，所扩增出的条带全部具有多态性，有的引物在二倍体野生种和品种的同一位点上可扩增1～2个条带，但在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ大类的多个远缘杂交品种上可扩增出3～4个条带，甚至更多，这与栽培金鸡菊复杂的染色体倍性有关。个别EST-SSR引物不能在全部100个金鸡菊种质上实现有效扩增，如异果组、轮叶组、两色组、歧序组相关的材料，这可能是由于本次开发EST-SSR引物时所采用的转录组数据以金鸡菊组的遗传背景为主，引物的通用性存在一定局限。但对于同为金鸡菊组的皇冠金鸡菊来说，同样存在扩增位点较少的问题，在聚类结果中未能划到Ⅰ类，这可能与其异常的染色体数目和缺失相应的遗传位点和有关。

杨占花等[31]认为，使用不同类型的SSR得到的聚类结果在大类群上区别不大，根据EST-SSR位点分析得到的UPMGA聚类图可将100个栽培金鸡菊种质分为7大类，前3类主要包括了绝大部分金鸡菊组、两色组、歧序组和轮叶组相关的种质，而大叶金鸡菊、掌叶金鸡菊、三叶金鸡菊、皇冠金鸡菊未能与同组的材料划为一类，异果组的沙漠金鸡菊更是独为一类，这可能是由于它们与栽培金鸡菊主要育种亲本具有一定的遗传距离，同时较少参与栽培金鸡菊的育种。据不完全统计，目前由世界各国育种家培育的金鸡菊品种约200～300个，本次试验收集的100个金鸡菊种质是世界各国广为栽培的种类，能够覆盖绝大部分栽培金鸡菊类型，具有较好的代表性，从聚类结果看，栽培金鸡菊主要由金鸡菊组、两色组、歧序组和轮叶组相关的种质培育而来，这与前人所报道的栽培金鸡菊的主要亲本较为一致[30]，不同组的金鸡菊种质具有一定的遗传距离，适合用于远缘杂交。

对于一些亲缘关系较近的种质，尤其是芽变产生的种类，多数分子标记难以做到区分，但也有一些学者开发出了合适的SSR、SRAP和S-SAP引物来区分桃[32]、柑橘[33]等植物的芽变品种。徐雷锋等[34]认为，采用分子标记对种质进行鉴定和区分时，所用的标记并不一定连锁重要的形态性状。高源等[35]也认为，不能完全区分和鉴定种质、或区分和鉴定的结果不理想，与检测的位点数不足有关。本次开发的22对引物仍有一定局限性，虽能较好地区分各个物种，并将大部分远缘杂交品种进行归类，但未能识别种下的各种质以及育种背景较为相近的杂交品种和相关的变异品种。Uri Dream系列是通过诱变培育的[36]，其中‘日落梦想’和‘粉色梦想’的遗传相似系数为1，它们的舌状花主花色都是粉色系，但前者具有橙色系的次花色，后者无次花色，而‘白色梦想’与两者的遗传相似系数为0.994 0，SSR位点可能发生了变异，它的舌状花主花色是白色系，次花色为粉色系。Lemonade系列的四个材料彼此之间的遗传相似系数也为1，它们的形态极为相似，但在舌状花主花色方面差别较大，可明显区分为为橙色系、粉色系、红色系和紫色系。综合来看，在实际应用中应将分子标记与形态标记充分结合才能对栽培金鸡菊进行更加准确地描述和区分。

图3 Lemonade系列和Uri Dream系列的头状花形态Fig.3 Flower heads of Lemonade series and Uri Dream series

4 结论

本研究基于剑叶金鸡菊‘斯丹泰勒’的转录组数据，搜索出SSR位点6 546个，并以此为基础成功开发出了22对EST-SSR引物，扩增出的166个条带全部为多态性条带。通过聚类分析，在遗传距离为0.460时可将100个栽培金鸡菊种质划分为7类，能在一定程度上反映栽培金鸡菊的育种背景，其遗传相似系数介于0.542 2～1，平均为0.747 6。金鸡菊组、两色组、歧序组和轮叶组相关的种质可作为金鸡菊远缘杂交育种的材料。本研究为栽培金鸡菊的鉴定、杂交育种及指纹图谱的构建等方面提供了一定分子方面的参考。