蒋希希，裴 斐，赵立艳，马 宁，方东路,3，仲 磊，胡秋辉,,*

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023；2.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095；3.南京林业大学轻工与食品学院，江苏 南京 210037）

在世界饮食文化中，鲜味是5种传统味觉之一，也是理论界最后一种承认的味道。鲜味以其特殊的味觉感受而备受人们喜爱，并且由于鲜味与其他滋味有良好的协同性，因此成为评价美食的重要指标之一。人们发现在肽、有机酸、核苷酸、氨基酸等物质中均有鲜味，在这些物质中，鲜味肽具有良好生理活性和风味活性，因此许多学者对其进行研究。最早在1969年Kirimura等发现拥有特定结构的小分子肽可能具有比游离氨基酸更强的滋味。随后，在各种食物中，陆续已经有100多种鲜味肽被发现。研究发现，鲜味肽对于食物中酸、甜、苦和咸等风味特征具有增强作用。因此，它可以应用于蔬菜、葡萄酒甚至乳制品的一些特殊风味的改良。与一些传统的鲜味物质相比，鲜味肽在口腔内保留时间更长的同时还缓解了喉咙干涩的现象，拥有更好的发展前景。目前关于鲜味肽的呈味特性等仍存在一定争议，因此需要探究新型鲜味肽阐明这些问题。

近年来，对食用菌原料鲜味物质的研究较多。食用菌不仅味道鲜美，而且营养价值高，对于高血压、心脑血管疾病等都有预防作用，深受广大消费者喜爱。食用菌是低脂高蛋白食物，是制备美味鲜味肽的理想原料。李雪通过感官评价及色谱技术，分离出具有较强的鲜味特性的组分，并在该组分中采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱技术鉴定出一个新的鲜味肽，其氨基酸序列为Glu-Gly-Thr-Ala-Gly，该鲜味肽能够引起鸡汤的浓厚感；Tsai等对6种不同食用菌的非挥发性风味物质进行研究报道。Cho等采用香气提取物稀释分析法以及气相色谱-嗅觉仪对松茸的特征活性化合物进行研究，研究表明，鲜味肽是引起食用菌鲜味的一种重要物质。Kong Yan等通过电子舌与感官分析确定了低分子质量组分（＜3 kDa）的鲜味最强，采用连续色谱技术从干香菇水解液中鉴定出5 条呈味肽，分别为Val-Phe、Cys-Met、Gly-Glu、Gly-Cys-Gly和Glu-Pro-Glu，这5 条肽对香菇的鲜味皆有重要贡献；李晓明等采用超高效液相色谱-串联质谱从白玉菇中鉴定得到6种鲜味肽，研究表明这6 条肽的分子质量皆在1 000 Da以下；同时6种合成肽具有鲜味增强作用，并且增鲜能力突出，对于鸡汤的咸味、鲜味和甜味都有增强作用。梁佳明等采用反相高效液相色谱（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）技术从红葱牛肝菌中鉴定得到3 条鲜味肽，均具有强烈鲜味。

鲜味肽是食品中广泛存在的呈味化合物，在海鲜类、肉类、鱼类、发酵食品等中均发现了鲜味肽的存在，肉类、鱼类等原材料与食用菌相比成本高。我国是食用菌产量大国，并且食用菌数量多且菌丝体和子实体均可直接利用提取鲜味肽。草菇属于伞菌目、光柄菇科、小包脚菇属，别名有苞脚菇，草菇菇体洁白，质地细腻，吃起来具有浓浓的鲜香味，同时蛋白质含量高，且蛋白质中甜鲜类氨基酸占比较高，具备制备鲜味肽的潜力。目前，对草菇的研究主要集中抗氧化活性、采后的贮藏及保鲜、多糖的提取上，对草菇鲜味肽的分离鉴定还鲜有报道。本研究以草菇为原料，采用超滤、凝胶过滤色谱、RP-HPLC从草菇水提物中分离纯化出鲜味肽，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）从中鉴定出鲜味肽的序列。并通过固相化学合成法反相合成的纯肽对草菇鲜味肽的呈味特性加以分析，旨在为草菇鲜味调味品的开发提供一定的理论依据，以提升草菇附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

草菇 中国五河众兴菌业科技有限公司；合成肽南京金斯瑞生物科技有限公司；蔗糖、盐、味精（均为食品级） 华润苏果亚东新城区店；柠檬酸（食品级）郑州皇朝化工产品有限公司；咖啡因（食品级） 郑州鸿祥化工有限公司；葡聚糖凝胶G-15柱填料 北京索莱宝科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

超滤膜分离装置 美国Millipore公司；HL-2F恒流泵、BSZ-100自动部分收集器 上海嘉鹏科技有限公司；HD-3紫外检测器 上海沪西分析仪器厂有限公司；FD-IC真空冷冻干燥机 西班牙TeLstar公司；1200系列高效液相色谱仪 美国Agilent公司；N-1001旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司；SA402B电子舌 上海精天电子仪器有限公司；UPLC-Q-TOF-MS联用仪美国Milford公司。

1.3 方法

1.3.1 草菇粗提液的制备

参照梁佳明等的方法并稍作修改，使用鼓风干燥机将新鲜的草菇烘干至恒质量，将草菇干品粉碎后过筛，筛网选择80 目。将过筛后的草菇粉和蒸馏水按料液比1∶40（g/mL），于室温25 ℃浸泡1 h，再100 ℃水浴90 min，4 ℃、8 000 r/min离心20 min，后取上清液备用。

1.3.2 草菇中鲜味肽的超滤膜分离

参照赵炫的方法并稍作修改。将草菇粗提液通过3 000 Da超滤膜，压力0.5 MPa，上样量2 L。收集分子质量小于3 000 Da的组分，经冻干后保存于-80 ℃备用待测。

1.3.3 凝胶色谱分离纯化草菇中的肽

参照李晓明等的方法并稍作修改。采用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-15对超滤组分进行分离纯化，葡聚糖凝胶粉末在过量超纯水中浸泡24 h进行溶胀，将溶胀充分的填料灌入到层析柱（直径1.6 cm、长80 cm）中，流动相为超纯水，紫外吸收波长为220 nm。为了使凝胶结合的更为牢固，将流动相以3 mL/min的流速对凝胶过滤层析柱冲刷5 h。然后将超滤后具有鲜味的组分用超纯水配比成10 mg/mL溶液，让其通过0.22 μm水相滤膜后以0.5 mL/min流速载入凝胶过滤层析柱上，收集出峰的组分。将对应一个峰的所有组分混合，冷冻干燥后用于下一步电子舌与感官评估。

1.3.4 RP-HPLC分离纯化草菇中的肽

该分离过程采用Gu Min等的方法并有所修改。将凝胶色谱分离纯化出的鲜味最佳组分用流动相配制质量浓度为10 mg/mL溶液，并通过0.22 μm滤膜过滤。选择Zorbax 300SB-C色谱柱（PrepHT，21.2 mm×250 mm），采用梯度洗脱，上样体积250 μL，流动相A相为含有0.05%三氟乙酸的超纯水，B相为含有0.05%三氟乙酸的乙腈，波长选择220 nm，具体流动相条件参考表1。将对应一个峰的所有组分混合，冷冻干燥后用于下一步的电子舌与感官评估。

表1 半制备高效液相色谱条件Table 1 Semi-preparative high performance liquid chromatography conditions

1.3.5 UPLC-Q-TOF-MS分离鉴定草菇中的肽

参照Xu Xiaodong等的方法并稍作修改，采用UPLC-Q-TOF-MS技术对RP-HPLC分离纯化出的鲜味最佳组分进行结构鉴定。采用BEH C色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；进样量10 μL；流速0.3 mL/min；洗脱液A为0.1%乙腈溶液，洗脱液B为0.1%甲酸溶液；柱温45 ℃；梯度洗脱条件：0～2 min，0% A、100% B；2～3 min，20% A、80% B；3～10 min，100% A、0% B。

1.3.6 定向合成目标肽

由UPLC-Q-TOF-MS鉴定得出的目标多肽由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，采用多肽固相合成并对其进行脱盐处理，获得纯度大于98%的4 条多肽。

1.3.7 感官评价

1.3.7.1 凝胶过滤色谱分离各组分的感官分析及滋味稀释分析

参照Zhang Jianan等的方法并稍作修改，选取10个感官评价员（5 男5 女），对草菇分离组分的鲜味进行评价打分。在正式感官评价之前，对10个评价员进行为期4 周的鲜味评价的培训。评分采用10 点制，0～2，可有可无；2～4，弱；4～6，中等；6～8，强；8～10，非常强。

将各组分溶液以体积比1∶1的比例逐步稀释，采用三角试验评估每一个稀释水平，直至评价人员无法从1 份肽溶液及2 份超纯水溶液中识别出肽溶液为止，记录此时溶液的稀释水平即为滋味稀释值。

1.3.7.2 RP-HPLC各组分及合成肽的感官分析

参照1.3.7.1节感官评价方法。

1.3.7.3 合成肽的鲜味阈值及增鲜阈值测定

将起始质量浓度为1 mg/mL的合成肽溶液逐级稀释，采用三角试验法，直到评价人员无法品尝出溶液中的鲜味，合成肽的鲜味阈值即为倒数第2个合成肽溶液的质量浓度值；在0.5 mg/mL味精溶液中添加草菇合成肽，等比例提高溶液中合成肽的质量浓度，直至可以明显品尝到溶液中的鲜味增加，合成肽的增鲜阈值即为此时溶液的质量浓度值。

1.3.8 电子舌检测

1.3.8.1 合成肽的剂量-反应实验

以0.5 mg/mL的味精溶液为母液，配制不同质量浓度的合成肽溶液，分别为0、5、10、15、20、25 mg/mL，对其进行感官与电子舌分析，合成肽的剂量-感官反应分析参照1.3.7节方法，合成肽的剂量-电子舌评价实验参照邴芳玲等的方法并稍作修改，利用电子舌中的传感器阵列对样品进行检测，此传感传感器阵列包括SCS、AHS、CTS、NMS、ANS 5 根传感器，分别代表苦味、酸味、咸味、鲜味和甜味。每个样品的采集时间为120 s，在蒸馏水中的清洗时间为10 s。每个样品做3个平行，重复检测6 次，取稳定后的3 次实验数据。

1.3.8.2 呈味效应解析的电子舌分析

使用氨基酸配制成与合成肽等质量比的5 mg/mL溶液，将其与合成肽溶液进行电子舌对比分析，电子舌分析方法参照1.3.8.1节。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 超滤和凝胶色谱分离纯化草菇中的肽

图1 A-I组分的Sephadex G-15凝胶层析分离图Fig. 1 Separation of the water extract of straw mushroom by gel chromatography on Sephadex G-15

实验材料为经超滤制得的分子质量小于3 000 Da的草菇鲜味组分（记为A-I）。如图1所示，超滤组分A-I经凝胶过滤色谱分离后，在保留时间60～260 min内，共获得F1、F2、F3和F4。分别收集各组分，冷冻干燥后进行电子舌分析及感官分析。

图2 凝胶过滤色谱分离组分的电子舌雷达图（A）和滋味稀释因子分析图（B）Fig. 2 Radar chart of electronic tongue responses (A) and results of taste dilution analysis of four fractions (B)

如图2A所示，电子舌分析表明这4种组分的味道特征相似，鲜味、咸味和甜味相对较强，苦味和酸味相对较弱。与其他组分相比，将A-I组分与凝胶色谱分离组分进行滋味稀释分析。结果如图2B所示，A-I组分的滋味稀释因子为92，而凝胶色谱分离组分中，F1组分的滋味稀释分析值为34，是层析组分中最高的，说明F1对整体的鲜味影响最大。在分离纯化鲜味肽的过程中，超滤只是一个压力驱动的膜分离过程，在这种过程中很难分离出分子质量精确的多肽，所以进一步采用凝胶分离进行纯化，以获得更精确的组分。凝胶色谱分离是利用分子筛原理，利用凝胶的网状结构，分子质量越大的组分在填料中渗透路径越短，则在色谱柱中的保留时间越短，从而达到分离的目的，本研究选用的G-15葡聚糖凝胶可有效分离小于1 500 Da的小分子肽，凝胶色谱过滤结果显示F1保留时间最短且对波长220 nm处响应值最高，F1组分可能是由分子质量为1 000 Da左右的小分子肽构成。通过图1与图2B比较发现，低分子质量组分F1与草菇水提物的味觉特性具有很好的相关性，并且表现出很强烈的鲜味，是草菇中关键的味觉物质。这些结果与前期研究高度一致，即低分子质量的组分构成食品中的主要味觉活性化合物，并且具有更强的鲜味，因此，F1组分极有可能含有目标鲜味肽。选取F1做下一步RP-HPLC分离纯化。

2.2 RP-HPLC分离纯化草菇中的肽

图3 F1组分的RP-HPLC分离图Fig. 3 Semi-preparative high performance liquid chromatographic separation of F1

如图3所示，F1组分经RP-HPLC分离后共得到4个组分，分别为F1-a、F1-b、F1-c和F1-d，相应的出峰时间为3.563、4.021、4.430、5.825 min，RP-HPLC根据分子的疏水性强弱进而将物质洗脱分离，出峰时间越短，则亲水性越强，F1-a的出峰时间最短，说明其亲水性较强，而亲性强弱与氨基酸性质有关，多数的甜鲜味氨基酸如丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、苏氨酸（Thr）以及天冬氨酸（Asp）等为亲水性氨基酸，多数的苦味氨基酸如苯丙氨酸（Phe）、缬氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）以及异亮氨酸（Ile）等为疏水性氨基酸，因此，F1-a可能含有较多的甜鲜味的亲水性氨基酸。分别收集各组分，冷冻干燥后进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

图4 RP-HPLC分离各组分的感官雷达图（A）及其电子舌PCA（B）Fig. 4 Radar map of taste profiles of RP-HPLC fractions (A) and principal component analysis of electronic tongue responses (B)

如图4A所示，经RP-HPLC分离的4组分鲜味特征强烈，在所有口味中占主导作用，苦味和咸味相对较弱。4组分中F1-a鲜味效果最佳，其次为F1-d，而F1-b和F1-c的鲜味值较低，呈鲜效果较差。如图4B所示，所有样品在PCA图上无重叠，表明电子舌可以有效区分RP-HPLC分离组分的滋味。与F1-b、F1-c和F1-d相比，经过纯化的F1-a滋味更接近于味精和F1组分，说明F1-a组分在草菇水解液中的鲜味最强，更接近于草菇的原始滋味，即草菇鲜味肽，结合图3表明F1-a可能含有较多的甜鲜味的亲水性氨基酸，因此选择F1-a组分进行质谱分析进一步解析鲜味肽结构。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS分离鉴定草菇中的肽

收集F1-a组分，通过UPLC-Q-TOF-MS鉴定其中的肽序列。如图5显示，在/376.07、728.48、745.45、408.32处质谱丰度较强，对这些质谱峰进行碰撞诱导裂解，并进一步对照Peaks Studio系统对肽序列进行自动数据检索，有4 条肽链得到了碎片分布均匀的二级质谱图和解谱序列可信度较高的评分（Peaks软件中推荐序列的分值大于60），最终得到分子质量分别为750.27、726.44、744.42、816.28 Da的肽序列，这4 条呈味多肽的肽序列为Asp-Asp-Cys-Pro-Asp-Lys（DDCPDK）、Leu-Val-Asp-Lys-Pro-Arg（LVDKPR）、Gln-Ala-Asp-Lys-Arg-Lys（QADKRK）、Asp-Thr-Phe-Asn-Asp-Lys（DTFNDK）。这4 条多肽均含有丰富的亲水性氨基酸，这与RP-HPLC分离后推测的结果一致。同时，有研究表明高比例甜鲜氨基酸的组成是多肽具有鲜味的关键因素，在本研究中，从草菇中鉴定得到的4种多肽中甜鲜氨基酸占比较高，其占比超过一半，表明F1-a组分中的多肽可能具有鲜味。另外，Rhyu等研究结果表明鲜味肽的分子质量一般均集中在1 000 Da以下，而本研究中所有肽的分子质量均集中在700～900 Da之间，这与前人研究结果一致且与推测结果一致，这表明草菇多肽可能具有良好的呈鲜效果。对其进行后续的合成并验证其鲜味特性。

图5 多肽的一级质谱和二级质谱图Fig. 5 Mass spectra and MS/MS spectra of identified peptides

2.4 草菇鲜味肽的呈味特性分析

2.4.1 鲜味肽的感官特性分析

将从草菇中鉴定出的4种鲜味肽定向合成后进行感官评价与电子舌分析，如图6A所示，合成后的4 条肽段滋味轮廓基本一致，5种滋味中鲜味和咸味较为突出，具有一定的甜味，苦味最弱。如图6B所示，4种合成肽的鲜味特征突出，其中DDCPDK的鲜味强度最高，其次为DTFNDK，鲜味相对较弱的为LVDKPR。鲜味肽的滋味丰富，往往不止一种味道，其中所有的合成肽均表现出了一定的酸味，这是因为肽链中的羧基解离强度大于氨基，溶液显酸性。

图6 合成肽的感官滋味轮廓图（A）和电子舌滋味轮廓图（B）Fig. 6 Sensory taste profiles (A) and E-tongue taste profiles (B) of synthetic peptides

将从草菇中鉴定出的4种鲜味肽进行定向合成，对其鲜味阈值及增鲜阈值进行确定。由表2可知，4种合成肽的鲜味阈值存在显著差异（＜0.05），DDCPDK的鲜味阈值最低，为0.10 mg/mL，说明其鲜味强度最高，QADKRK的鲜味阈值最高，为0.42 mg/mL，说明其鲜味强度最低。同时4种肽表现出不同的增鲜能力，增鲜阈值差异显著（＜0.05），其中DDCPDK的增鲜阈值最低，在0.02 mg/mL时对0.5 mg/mL味精溶液就能起到明显的增鲜作用，其他3 条鲜味肽的增鲜阈值在0.03～0.18 mg/mL之间，说明这3 条鲜味肽比DDCPDK需要更高浓度达到相同增鲜效果，因此DDCPDK的鲜味增强能力最强。

大量研究表明鲜味肽的鲜味与其氨基酸组成及肽链的构象有关。从氨基酸组成看，多肽DDCPDK呈现最低的鲜味阈值（0.1 mmol/L），可能与组成上有4个鲜味氨基酸片段（Asp-Asp、Asp）有关。多肽QADKRK呈现最高的鲜味阈值（0.42 mmol/L）且带有苦味，其组成上含有碱性氨基酸（Lys、Arg），而多肽中碱性氨基酸的存在会促进苦味的感知，这可能是多肽QADKRK带有一定苦味的原因。另外，Shibashi等研究结果表明，苯丙氨酸（F）属于苦味氨基酸，并且具有增强多肽苦味的能力，这可能是多肽DTFNDK也呈有一定苦味的原因。Liu Ziyuan等对从红鳍东方鲀中分离鉴定的7 条鲜味肽序列进行分析，发现末端含有精氨酸（R）的肽序列呈现苦味且阈值较高，多肽LVDKPR末端也含有精氨酸，这可能也会使多肽苦味增加，从而抑制多肽的鲜味值。

表2 合成肽的鲜味阈值及增鲜阈值Table 2 Umami thresholds and umami-enhancing thresholds of synthetic peptides

2.4.2 鲜味肽的呈味效应解析

图7A、7B整体趋势相同，这是由于电子舌可以对液体样品的“指纹”信息进行分析，从而对样品进行定性或定量分析。邴芳玲等使用电子舌结合感官评价对食用菌的鲜味强度进行评价，验证了电子舌分析和感官评价具有一致性。图7A与7B均直观反映了鲜味模型中合成肽的释放和消失对模型鲜味的影响。草菇中4种肽的增鲜曲线均呈先升高后降低的趋势，所有合成肽的鲜味峰值质量浓度均为20 mg/mL，当在鲜味峰值浓度时，4种肽的鲜味增强能力差异显著（＜0.05），其中DDCPDK的鲜味增强能力突出，相比之下DTFNDK的增鲜能力较弱。

图7 合成肽在味精溶液中的剂量-感官曲线（A）以及剂量-电子舌曲线（B）Fig. 7 Umami-enhancing effect of synthetic peptides at different concentrations on monosodium glutamate solution as determined by sensory evaluation (A) and electronic nose (B)

如图8所示，4 条合成肽与其等质量配比的氨基酸混合液的呈味特性均存在明显差异。如图8A所示，DDCPDK是以鲜味为主，而混合液则是以甜味为主，其甜味是由天冬氨酸引起；如图8C所示，QADKRK本身以鲜味为主，而混合液以甜味为主，其甜味是由丙氨酸引起；如图8D所示，DTFNDK本身以鲜味为主，而混合液以甜味为主，其甜味是由苏氨酸引起的。DDCPDK、QADKRK以及DTFNDK这3 条合成肽溶液的甜味与鲜味均显著高于其混合液，表明甜味氨基酸（天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸）在与其他氨基酸通过肽键结合后会改变其呈味特性。如图8B所示，LVDKPR是以鲜味为主，而混合液以苦味为主，其苦味是由亮氨酸引起的，合成肽LVDKPR溶液的苦味与鲜味显著高于混合液，表明呈强苦味的亮氨酸在与其他氨基酸通过肽键结合后会改变其呈味特性。因此，研究结果表明这4 条草菇鲜味肽的呈味特性其实并非由单个氨基酸滋味简单叠加而成，而是氨基酸通过肽键形成特定的结构引起，这与Zhuang Mingzhu等的研究结果相似。同时发现当草菇鲜味肽添加量超过20 mg/mL后，鲜味肽的酸味会使溶液的酸味强度升高，同时会对溶液鲜味的产生抑制，这表明鲜味肽的添加量是有一定的限制，最佳添加量为20 mg/mL。

图8 合成肽与等质量配比的氨基酸混合液的感官评价分析对比图Fig. 8 Comparison of taste intensity of synthetic peptides and amino acid mixture at 1:1 mass ratio

3 结 论

依次采用超滤、凝胶过滤色谱和RP-HPLC从草菇水提物中分离纯化出多肽组分F1-a，并基于电子舌分析与感官评价证明其具有较强的鲜味。利用UPLC-Q-TOF-MS进一步鉴定出F1-a组分主要含有DDCPDK、LVDKPR、QADKRK和DTFNDK这4 条短肽。本研究发现鲜味肽的呈味特性是氨基酸通过肽键形成特定的结构引起；从草菇中分离鉴定出的4种短肽既是鲜味肽也是鲜味增强肽，鲜味阈值在0.10～0.42 mg/mL之间，增鲜阈值在0.02～0.18 mg/mL之间，其中短肽DDCPDK对味精溶液的增鲜效果最佳，且最佳添加量为20 mg/mL。研究结果为草菇鲜味调味品的开发提供一定理论依据，以提升草菇附加值。