王艺会，蔡 淼，张 敏，赵 华，刘 京，杨贞耐

（北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

蛋白质水解是一种广泛应用于改善食品理化、功能和感官特性的技术。蛋白质在蛋白酶作用下能够产生多种生物活性肽，这些作为天然、安全、有益的功能成分，可改善蛋白质的营养、生物活性和功能特性。乳蛋白水解物可以作为一种食品添加剂，进一步改善食品的功能特性，如发泡乳化能力、凝胶形成能力、黏度、质地和持水力，最终改善或者增强产品的营养特性。已有研究发现，水解蛋白用于酸乳加工，可以缩短发酵时间，提高乳酸菌的活菌数。Lin Jinzhong等将猪肉的猪胃蛋白酶水解产物添加至牛乳中制作酸乳，可以提高酸乳的酸化速率以及产品的活菌数和游离氨基酸总量，并改善产品的口感，增加酸类、醇类、醛类、酮类、酯类等风味化合物的含量。

酪蛋白是牛乳中的主要蛋白质，含有丰富的必需氨基酸，有利于乳酸菌的生长，同时是营养价值最高的蛋白质之一，经蛋白酶水解后可产生多种生物活性肽。徐慧等利用胰蛋白酶水解酪蛋白得到的酪蛋白磷酸肽应用于酸乳加工，发现其可以缩短发酵时间，并大幅提高酸乳中的活菌数，从而改善酸乳品质。Zhang Qingli等在酸乳中添加酪蛋白的木瓜蛋白酶水解产物，发酵剂菌株的生长代谢和发酵动力学得到改善，其中分子质量小于3 kDa的水解物组分显著减弱了酸乳的后酸化现象，提高了发酵剂菌株的活菌数，进而提高了酸乳品质。胡志和等将具有富含血管紧张素转换酶抑制活性的酪蛋白水解物应用于酸乳加工，动物实验结果表明该酸乳具有良好的降血压和保护肝脏作用。添加经碱性蛋白酶水解的酪蛋白酸钠产物可以缩短发酵时间，改善酸乳质构。目前有关菠萝蛋白酶水解酪蛋白的活性产物对酸乳加工特性的影响研究较少。

本研究将前期获得的基于菠萝蛋白酶的酪蛋白水解肽（casein hydrolytic peptides，CHP）应用于酸乳发酵。CHP分子质量小于1 kDa的片段富含4～11个氨基酸的肽段，具有良好的生物活性，如抗氧化和金属离子螯合活性。为此，本研究探究添加菠萝蛋白酶CHP酸乳的加工特性，包括酸乳发酵及冷藏过程中pH值、微流变特性、微观结构以及风味等的变化，以期为进一步利用CHP改善酸乳品质和功能性提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜牛乳 北京三元食品股份有限公司；菠萝蛋白酶（50 000 U/g） 河南三化生物科技有限公司；酸乳发酵剂YO-MIX 300 LYO 丹麦丹尼斯克公司；超滤膜（1 kDa） 美国密理博公司；氢氧化钠、氯化钠国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9032恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；FE20型数显pH计 上海仪电科学股份有限公司；MLS-3750高压灭菌锅 日本Sanyo公司；Master微流变仪法国Formulaction公司；iCinac乳品发酵监控仪 法国AMS-Alliance公司；CT3质构仪 美国Brookfield公司；7890A-7000气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；CR21III低温冷冻离心机 美国Bio-Rad公司；SU8020场发射扫描电子显微镜 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 CHP的制备

参考Mudgil等的方法，配制质量浓度10 g/100 mL的酪蛋白溶液，加入菠萝蛋白酶，调节温度42 ℃和pH 6.8，酶解12 h后取出样品，沸水浴（100 ℃）加热10 min，停止酶解反应。样品冷却后，4 ℃、10 000 r/min离心15 min，去除沉淀，上清液经适宜分子质量大小（＜1 kDa）的超滤膜过滤后冻干备用。

1.3.2 酸乳制作

将牛乳置于65 ℃下杀菌处理30 min，冷却至室温后，直投加入4（lg（CFU/mL））的发酵剂和不同量CHP（0.1%、0.3%、0.5%，即在添加发酵剂基础上分别添加1、3、5 mg/g CHP），42 ℃下发酵使pH值达到4.5，迅速冷却后在4 ℃冷藏。对照组仅加入发酵剂。

1.3.3 发酵过程中酸乳pH值及微流变学的测定

采用iCinac乳品发酵监控仪测定酸乳发酵期间的pH值变化。

取20 mL样品至样品池中，将样品池插入微流变仪，设定参数运行程序，在42 ℃下测定酸乳发酵过程中的弹性指数（elasticity ndex，EI）、流动性指数（fluidity index，FI）和宏观黏度指数（macroscopic viscosity index，MVI），每隔5～10 min记录一次数据。

1.3.4 冷藏过程中酸乳各项指标的测定

将酸乳于4 ℃冷藏21 d，测定酸乳冷藏过程（1、7、14、21 d）中的各项指标。

采用pH计测定冷藏过程中样品的pH值。参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定酸乳样品中发酵剂活菌数。采用微流变仪，在24 ℃测定样品EI、MVI和FI。参考蔡淼等的方法测定酸乳质构指标，记录酸乳样品第1循环的硬度、胶着性、黏性、内聚性等指标。

将15 g样品装入离心管，测定其质量，离心去除上清液后，测定剩余质量。持水力按下式计算：

式中：为空离心管质量/g；为样品和离心管质量/g；为剩余沉淀和离心管质量/g。

酸乳的微观结构：酸乳样品用质量分数2.5%戊二醛溶液（pH 6.8）固定，4 ℃下冷藏过夜后在液氮中冷藏。取出样品，切片，用磷酸盐缓冲液（pH 6.8）洗涤3 次，每次10 min。采用乙醇梯度脱水，然后用氯仿脱脂2 h，期间间隔振荡，以叔丁醇置换乙醇，用无水乙醇冲洗10 min，再用无水乙醇-叔丁醇（1∶1，/）、纯叔丁醇各冲洗1 次，每次6 min。冻干后固定观察面，镀金，观察微观结构。

挥发性风味化合物的测定：采用固相微萃取法（solid phase micro solid，SPME）吸附酸乳中挥发性风味物质，采用气相色谱-质谱仪测定酸乳挥发性的风味物质。准确称取10 g样品，以2-甲基-3-庚酮为内标放入萃取瓶中。样品在40 ℃水浴中密封平衡30 min；SPME纤维顶空吸附30 min，在250 ℃下持续5 min对化合物进行解吸附。气相色谱条件、升温程序和质谱条件均参考罗天淇等的方法，通过与NIST08数据库进行质谱比对，对化合物进行鉴定，用内标法进行定量分析。

1.3.5 酸乳的感官评定

参考文献[19-20]和GB 19302—2010《发酵乳》进行酸乳的感官评定。由10 名具有感官评价经验的评价员分别对冷藏1、7、14、21 d的酸乳，从口感、色泽、滋味、气味和组织状态5个方面进行评定，结果取平均值。评分标准见表1。

表1 酸乳感官评定标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of yogurt

1.4 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 酸乳发酵过程中pH值和微流变学变化

如图1所示，发酵过程中所有样品的pH值均先下降，在约150 min后趋于相对稳定。各组pH值的差异主要体现在发酵后期，添加CHP能够提前到达酸乳发酵终点（pH 4.5），缩短酸乳发酵时间，其中，CHP添加量为0.1%的酸乳发酵时间最短，为203 min，较对照组缩短了34 min。据报道，添加碱性蛋白酶的酪蛋白酸盐水解物能够加速发酵凝乳，缩短酸乳发酵时间，主要是因为乳酸菌合成氨基酸的能力较低，而酪蛋白水解物含有必需氨基酸，能够促进益生菌和酸乳发酵剂的生长，从而缩短发酵时间。但是本研究发现，并非CHP添加量（如0.3%、0.5%）越多发酵时间越短，这可能是由于菌株对促生长因子的利用有最大浓度限制。

图1 不同CHP添加量酸乳发酵过程中pH值的变化Fig. 1 Changes in pH of yoghurt with different amounts of CHP during fermentation

酸乳的持续发酵使pH值逐渐下降，乳中的微粒状态也会相应发生变化。如图2A所示，在凝胶形成前，即第110分钟前，此时样品弹性较低，各组EI变化不明显，说明在酸乳发酵初期，CHP的加入对凝胶化无显著影响；之后牛乳逐渐凝胶化，EI快速增加。在150 min左右EI缓慢增加，此时凝胶结构已相对稳定，样品弹性增加。各组EI的变化差异表明CHP的加入可降低凝乳的弹性，且降低程度与CHP添加量相关。如图2B所示，110 min前，所有样品MVI处于较低水平，此时样品处于液体状态，黏性较低；发酵至第110分钟，凝胶化的出现使4组样品的MVI迅速升高，之后进入平稳期，约30 min后又缓慢上升，约200 min达到最大值；这一阶段，酪蛋白胶束聚集后，形成相对稳定的网状结构，黏性增加。在发酵后期，3个实验组的MVI 变化率均高于对照组，表明适量添加CHP可以提高酸乳样品的黏稠性，更快达到发酵终点，各实验组差异不明显。如图2C所示，在发酵前110 min，各组FI均处于较高水平，波动较小，样品处于液态，样品中的颗粒具有很强的流动性。FI能反映酸乳中小颗粒运动速度的快慢，FI越大，颗粒运动越快，流动性越强。110 min之后凝胶开始形成，FI下降速度较快；脱水缩合和凝胶结构趋于相对稳定后，FI继续下降，且实验组比对照组样品的下降速度快，更快达到发酵终点，但3个实验组之间无明显差异。在发酵过程中，添加CHP主要对发酵后期的酸乳产生影响，CHP一定程度地促进稳定凝乳胶体结构的形成。

图2 不同CHP添加量酸乳发酵过程中微流变指标EI（A）、MVI（B）和FI（C）的变化Fig. 2 Changes in EI (A), MVI (B) and FI (C) of yoghurt with different amounts of CHP during fermentation

2.2 CHP对酸乳微观结构的影响

图3 显示了冷藏1 d后各组酸乳的微观结构。不同添加量CHP导致酸乳网状结构存在一定差异，其中对照组样品网孔较小，存在少量空隙结构；0.1%组酸乳网络结构较致密均匀；0.3%和0.5%组凝乳表面较为粗糙，存在较多空隙，尤其是0.5%组孔隙最大。因此适量添加CHP（如0.1%）可以改善酸乳的胶体结构。Ren Xiaoqing等的研究中也有相似报道，主要归因于CHP的存在可能对酸乳中酪蛋白胶束的聚集具有一定程度影响，-乳球蛋白的热变性及其与酪蛋白之间的相互作用也发生变化。Barbeau等发现，-乳球蛋白在溶液中的热变性因特定肽段的存在而降低，可能是因为肽通过离子或疏水相互作用稳定了乳球蛋白的结构。因此，肽可能阻止变性-乳球蛋白和牛奶中酪蛋白胶束表面之间相互作用。在肽存在的情况下，变性-乳球蛋白与酪蛋白胶束之间相互作用程度较低，这可能导致添加CHP酸乳的网络结构较为粗糙。有关CHP添加对-乳球蛋白变性程度的影响及其与酪蛋白胶束之间的相互作用有待进一步研究。

图3 不同CHP添加量酸乳（冷藏1 d）的微观结构Fig. 3 Microstructure of yoghurt (cold storage for 1 d) with different amounts of CHP

2.3 酸乳冷藏过程中pH值和活菌数的变化

如图4所示，在整个冷藏期间，各组酸乳样品pH值均呈不同程度的下降趋势，对照组酸乳pH值从初始的4.50下降到4.41，实验组酸乳pH值从初始的4.46左右下降到4.35左右，表明在冷藏过程中乳酸菌仍然产酸，即发生了后酸化现象。同时，3个实验组酸乳的pH值（约4.35）始终低于对照组（约4.41），但各实验组样品之间pH值变化没有明显差异，说明添加CHP可以降低酸乳冷藏期间的pH值。

图4 不同CHP添加量酸乳冷藏过程中pH值的变化Fig. 4 Changes in pH of yoghurt with different amounts of CHP during cold storage

图5 不同CHP添加量酸乳冷藏过程中保加利亚乳杆菌（A）和嗜热链球菌（B）活菌数的变化Fig. 5 Changes in viable cell counts of Lactobacillus bulgaricus (A) and Streptococcus thermophilus (B) in yoghurt with different amounts of CHP during cold storage

酸乳冷藏过程中乳酸菌活菌数的稳定性对其品质具有重要作用。如图5所示，在各组酸乳冷藏期间，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌活菌数均高于6（lg（CFU/mL）），达到GB 19302—2010的要求，且这两种菌的活菌数变化趋势大致相同，即二者活菌数均先升高，在第7天时达到最大值，而后趋于下降。这可能是由于冷藏前期发酵剂菌株继续生长导致活菌数先增加，而后可能由于酸积累、发酵剂相互作用、溶解氧及过氧化氢水平以及贮藏条件的影响，乳酸菌的生长条件发生变化，使第7天后活菌数下降。

在第1、7天时各组样品保加利亚乳杆菌活菌数无明显差异，第7天时达到最大值（7.96（lg（CFU/mL）））后，继续冷藏至第21天时，对照组的保加利亚乳杆菌活菌数较第7天时下降了5.69%，0.1%、0.3%、0.5%组分别下降了2.61%、4.27%、4.92%，表明添加一定量的CHP提高了酸乳冷藏过程中保加利亚乳杆菌的活菌数，以0.1% CHP效果最为明显。

各组样品的嗜热链球菌活菌数均在第7天时达到最高值，与第1天相比，除0.5%组的活菌数仅提高了0.29%，其余各组活菌数均提高了10%以上，继续延长冷藏时间，活菌数开始下降，在第21天时，对照组活菌数较第7天时下降了2.64%，0.1%、0.3%、0.5%组分别下降了2.44%、3.83%、2.32%，表明添加一定量CHP可能会促进菌株的增殖。同时所有样品的嗜热链球菌活菌数始终高于保加利亚乳杆菌，这可能是由于嗜热链球菌对限制性营养物质的利用更有优势。保加利亚乳杆菌在第1、7天时各组样品活菌数无明显差异，但冷藏至第14、21天时，3个实验组的活菌数均高于对照组，这可能与添加CHP对菌株的促增殖作用相关。Lin Jinzhong等发现，冷藏第1、14天时，添加5%和10%猪肉蛋白水解产物的酸乳样品中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌含量显著高于对照组，但1%添加水平对其无显著影响。Dąbrowska等发现乳清蛋白水解物能够提高酸乳发酵剂菌群数量，并显著抑制4 ℃贮藏过程中活菌数的下降，该水解物还能提高青春双歧杆菌的生存能力，但对双歧杆菌的增殖无显著影响。此外，大豆分离蛋白水解液的添加也可以增加酸乳冷藏期间嗜热链球菌的活菌数。

2.4 CHP对酸乳冷藏过程中微流变学和质构特性的影响

由图6所示，冷藏期间各组酸乳样品的EI先降低，然后小幅波动；与对照组相比，添加CHP降低了酸乳的EI；MVI和FI在冷藏期间出现不同程度波动，但不同添加量CHP均未对MVI和FI的变化造成明显影响。贮藏第14天时，与对照组相比，0.3%和0.5%组的MVI略有下降，但FI均有所提高。此外，样品的EI、MVI和FI变化可能与酸乳冷藏过程中后酸化引起的凝胶结构变化有关。在酸乳凝胶体系中，酪蛋白分子聚集形成的多孔网状结构可容纳水分和其他小分子物质。

图6 不同CHP添加量酸乳冷藏过程微流变指标EI（A）、MVI（B）、FI（C）的变化Fig. 6 Changes in EI (A), MVI (B) and FI (C) of yoghurt with different amounts of CHP during cold storage

如表2所示，所有酸乳样品持水力为50.17%～54.86%，添加CHP能够一定程度改善酸乳的持水力，但是随冷藏时间的延长，各样品的持水力未发生明显变化，可见添加CHP未破坏酸乳凝胶结构。随冷藏时间的延长，所有样品的内聚性变化不明显，测定值在0.42～0.47之间。而硬度随冷藏时间的延长均呈现上升的趋势，这可能是冷藏期间酸乳凝胶结构增强的结果。添加0.3%、0.5% CHP的胶着性随贮藏时间的延长先上升后下降，而黏性变化不明显。酸乳的硬度和胶着性随CHP添加量的增加而降低，且降低幅度与CHP含量有关；CHP添加量较高时，酸乳的硬度和胶着性显著下降（＜0.05）。Ma Yanshi等发现，添加鱼明胶和牛明胶水解产物可以降低酸乳冷藏过程中第1、21天时的硬度。本研究添加CHP导致酸乳硬度和胶着性下降可能是由于CHP改变了酸乳发酵时间和发酵剂菌株的代谢，并且与乳蛋白相互作用形成凝胶网络，从而影响酸乳的质构及物理性质。此外，冷藏过程中各组样品黏性差异不显著（＞0.05），表明添加CHP未影响酸乳黏性。

表2 不同CHP添加量酸乳冷藏过程中质构特性的变化Table 2 Changes in texture properties of yoghurt with different amounts of CHP during cold storage

2.5 CHP对酸乳冷藏过程挥发性风味化合物的影响

风味是评估酸乳品质的主要指标之一。如表3所示，在4组酸乳样品中共有23种挥发性风味物质被检测出，其中酸类5种、醛类6种、酮类7种、其他类5种。

酸类物质具有清爽的口感和乳香味，是酸乳风味的重要组成部分，挥发性较强的中短链脂肪酸如丁酸赋予酸乳独特的奶油味，己酸在低浓度下呈现一定奶香味，辛酸具有淡淡的果酸味，癸酸具有脂肪味，这些酸类物质会影响酸乳的风味。冷藏1 d时，添加CHP增加了酸类物质含量，并且CHP添加量越高酸类物质含量越高，0.5%组最为明显。随着冷藏时间的延长，实验组酸类物质含量低于对照组，其中以丁酸、己酸含量变化最为明显，可能是由于CHP的添加会吸附部分风味化合物，进而降低了部分酸类物质含量。

牛乳中游离脂肪酸的自氧化和微生物代谢产生各种醛类，如己醛、辛醛、苯甲醛和糠醛物质，醛类能增强酸乳的鲜味，新鲜牛奶含有己醛、庚醛和辛醛。己醛呈青草味，壬醛具有柑橘和玫瑰香气；辛醛具有较强的水果味；癸醛具有橙皮香味；苯甲醛有坚果和杏仁的香味。月桂醛具有强烈的似松叶油和橙油香气。冷藏期间实验组与对照组酸乳的醛类物质含量存在一定差异，添加CHP能够增加冷藏第1、7、14天酸乳中醛类物质的含量。

在酮类物质中，2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮是形成酸乳风味的主要成分，3-羟基-2-丁酮含量在第21天有所降低，说明酸乳在冷藏过程中风味出现一定损失。比较实验组和对照组发现，添加CHP导致2,3-丁二酮含量略有下降，且在添加水平较高（0.3%、0.5%）时下降更为明显，但添加0.1% CHP时，2,3-丁二酮含量高于对照组，说明适量添加CHP能够改善酸乳风味；实验组中2-壬酮和3-羟基-2-丁酮的含量随贮藏时间延长而增加，第21天时略有降低；在1～14 d添加量为0.3% CHP的2-庚酮含量高于对照组，2-庚酮、2-壬酮具有类似奶酪的香气。

添加CHP对酸乳冷藏过程中挥发性风味物质总含量有一定影响，以第21天时酸乳挥发性风味化合物含量下降较为明显，可能是CHP影响了发酵剂菌株的某些代谢过程。

由图7可知，添加0.1% CHP会影响酸乳中的风味化合物。0.1% CHP组和对照组酸乳在冷藏第1天时风味成分变化不大；冷藏第7天时，0.1% CHP组中2,3-丁二酮（1）、2-庚酮（3）、4-辛酮（4）、月桂醛（13）等物质对酸乳风味影响较大，是此冷藏阶段的主要风味物质；冷藏第14天时，0.1% CHP组中的主要风味物质有2,3-戊二酮（2）、二氢-2-甲基-3(2)-噻吩酮（7）、2-壬酮（6）、3-羟基-2-丁酮（5）、苯甲醛（12）、乙酸（14）、丁酸（15）、己酸（16）等，酸乳的风味成分达到最佳；至冷藏第21天，与对照组相比，0.1% CHP组风味化合物含量有所下降，乙酸（14）、丁酸（15）、己酸（16）等酸类物质与样品风味呈负相关，说明冷藏时间延长会对酸乳风味造成一定影响。PCA结果表明，添加CHP一定程度上有利于酸乳风味的形成。

表3 不同CHP添加量酸乳冷藏过程挥发性风味物质含量的变化Table 3 Variation in volatile flavor substances in yoghurt with different amounts of CHP during cold storage ng/g

图7 0.1% CHP组和对照组酸乳冷藏过程中挥发性风味化合物的PCA图Fig. 7 Principal component analysis plot of volatile flavor components in yogurt with 0.1% CHP

2.6 CHP对酸乳冷藏过程感官品质的影响

如图8所示，冷藏期间添加0.1% CHP酸乳的感官评分始终高于对照组，在第7、14天时，其感官评分分别较对照组提高了5.81%、9.85%，说明添加CHP改善了酸乳的整体风味，使酸乳的口感更加细腻，增加了酸乳香气，且质地均匀。但当CHP添加量增加到0.3%和0.5%时，会对酸乳的感官造成影响，一定程度降低酸乳风味，表明适量添加CHP有助于改善酸乳品质，CHP可以用于酸乳的制作，以增加其功能价值。

图8 CHP对酸乳冷藏过程中感官品质的影响Fig. 8 Effect of CHP on sensory evaluation of yogurt during cold storage

3 结 论

添加CHP制备酸乳，发现添加CHP能缩短酸乳发酵时间，改善流变学特性，0.1% CHP可以使酸乳网络结构更加致密均匀，但CHP添加量增大至0.3%和0.5%，会使凝乳表面变粗糙，因此，一定添加量有利于酸乳的加工。在冷藏第21天时，0.1% CHP和0.5% CHP组的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌活菌数的下降速率低于对照组。CHP的添加会降低酸乳的硬度和胶着性，根据流变学指标、质构、风味和感官等综合评定，添加一定量CHP（0.1%）有利于改善酸乳的风味、质地和口感。将菠萝蛋白酶水解酪蛋白的活性肽应用于酸乳，有助于功能性酸乳的研发和加工。