陈梦冰李梦华吴俪媛 陈伟乔月华林昶*

1福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科（福州 350005）

2暨南大学第二临床医学院（深圳市人民医院）耳鼻咽喉头颈外科（深圳 518020）

3徐州医科大学听觉与平衡医学研究所（徐州 221004）

4中国人民解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科（北京 100853）

2021年世界卫生组织（WHO）最新发布《世界听力报告》表明，全球听损患者已超过15亿人，约占总人口数的1/5，其中4.3亿人较好侧听力损伤也达到中度或以上水平；到2050年，预计1/4的人口（约25亿）存在听力问题，其中需要康复治疗患者高达7亿人乃至更多；近80%的听力受损者多集中在中低收入国家，而其中多数患者因各种原因可能无法获得有效干预治疗[1]。众所周知，环境噪声影响人类健康。噪声性听力损失（Noise-induced Hearing Loss，NIHL）又称噪声性聋，是由损伤性强噪声刺激引起的因内耳毛细胞损伤所产生的一种进行性感音神经性聋，可伴听觉过敏、耳鸣等症状。噪声性聋发病机制复杂，近十年听力学家普遍认为高强噪声导致的听功能损伤与耳蜗毛细胞死亡有关[2,3]，造成永久性听力损害[3,4]。然而近年来，人们发现一些强度有限的“安全”噪声也可对人类听觉功能造成损害。如长年驾车的货车司机、建筑工人、乐手和军事作战人员等人群的听力水平和嘈杂环境中的言语识别能力显著低于同年龄人群的平均水平[5,6]，这种不改变听阈但影响言语辨识功能的阈上听觉感知功能缺陷被称为“隐匿性听力损伤状态”（Hidden Hearing Loss，HHL），目前认为该过程与突触病变有关[7]。目前全球总人口中的12%存在听觉问题，而其中约三分之一的病例可归因于既往噪声暴露史[8]。然而由于噪声介导听功能变化个体差异较大，且剂量效应各有不同，因此目前针对噪声后听力损伤危害性评价及相关机制尚缺乏系统性研究。然而大量听障人群会因为自身生理缺陷，导致社会参与度降低，长期自我隔离，严重者可进一步发展为抑郁症[9]、老年痴呆[10]等神经系统疾病，同时也会随之带来巨大的社会负担[11]。

人类生产生活中所接触到的噪声类型多样、频率各异、强弱不同，亟需我们关注的当是最常见、频率分段上的功率在整个可听范围（20-20kHz）内均匀的白噪声，以及工业生产中产生严重职业危害的高频噪声（2kHz以上，常见于各种工业机器），它们对听觉系统的损害轻则表现为短时间内即可恢复的暂时性听阈升高（暂时性阈移），重则造成永久性的听力降低甚至全聋（永久性阈移），此间因果尚有挖掘余地。因此，系统性探究常见噪声对听觉感受器中的关键细胞（内、外毛细胞）的损伤特点，比较其对不同噪声的易损性，将有利于为未来生产生活中噪声危害评定、噪声相关防护，以及噪声后可逆转阶段特定窗口期内药物干预等重要临床医学课题研究奠定必要的理论基础。

依据文献调研，本研究采用以下小鼠噪声暴露损伤模型，以100dB SPL白噪声造模导致小鼠出现隐匿性听力损伤状态[12]；120dB SPL白噪声导致永久性听力损伤[13]；116dB SPL，8-16kHz窄带噪声为全聋损伤[14-16]；同时以未进行噪声处理小鼠为对照组。对白噪声和高频带宽噪声暴露后小鼠听功能受损情况进行详细研究（包括：阈值，I波幅值和潜伏期），同时重点关注内、外毛细胞在不同噪声暴露后的损伤情况。这些数据将为人类噪声防治和隐匿性听力损失研究提供重要数据参考，具有深远意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验全部采用斯贝福（北京）生物技术有限公司出售的SPF级雄性5-6周龄C57BL/6J小鼠。新购入的小鼠适应性饲养2-3天后，行听性脑干反应（Auditory Brainstem Response,ABR）进行全频筛查，排除听力异常小鼠。根据前文实验规划，将筛出的正常小鼠随机分为4组：100dB SPL白噪声组（100dB）；120dB SPL白噪声组（120dB）；116dB SPL，8-16kHz窄带噪声组（116dB 8-16kHz）和对照组（Ctrl）；每组12只。噪声暴露处理2h，24h后重复一次，拟定二次噪声结束后当天为第0天（NE-0d），则于二次噪声结束后1天（NE-1d）、7天（NE-7d）、14天（NE-14d）进行相关数据采集。

1.2 噪声建模

分别对各个实验组进行相应的噪声暴露处理，噪声暴露采用本课题组既往的方案[13,17]，造模方案可靠、效果稳定，即：选择相应频带的噪声声音文件进行播放，噪声暴露2h，24h后重复一次，每个实验组累计进行4h的噪声暴露。噪声暴露期间，将每一组12只小鼠分别置于噪声专用鼠笼中，鼠笼内有独立分隔网分隔开每只小鼠以防止抱团现象，扬声器紧扣于鼠笼上方。每次实验前用标准声级计测量鼠笼内噪声强度，以保证鼠笼内噪声强度符合设定标准。

1.3 听觉功能检测

本实验室采用的是美国TDT公司配套测听系统（Tucker-Davis Technologies,RZ6）进行ABR检测评估小鼠噪声暴露后听觉系统损伤情况，包括短声Click和短纯音4k、8k、16k、24k的阈值和I波幅值、I波潜伏期。小鼠测听前使用1%戊巴比妥钠（10μL/g，腹腔注射）进行麻醉，使用37℃恒温小动物加热垫进行保暖以保持生命体征平稳，正确安装操作测听专用针式电极，将喇叭给声口置于测试耳外耳道口相应位置，以每10dB依次递减给声（因本实验室设备限制，Click、4k、8k给声从90dB到10dB依次递减，16k、24k给声从80dB到10dB依次递减），直到检测不出规律波形，再增加5dB，测出可重复的规律波形，即可读取听阈值[18]，同时记录该频率最高声强的I波幅值与潜伏期。相同方法操作各实验组和对照质控组的每只小鼠双侧耳。

1.4 耳蜗基底膜解剖

各组各时间点小鼠测听结束后颈部脱臼处死小鼠，迅速将耳蜗取出放入盛有4%多聚甲醛的培养皿中，并立即在立体解剖显微镜下进行耳蜗灌流，浸入5mL 4%多聚甲醛溶液中于4°C冰箱过夜充分固定。第二天取出标本浸泡入5mL 10%EDTA溶液，于摇床上脱钙6-8h。脱钙完成后即可置于装有PBS的培养皿中，进行耳蜗基底膜的精细解剖，缓慢剥去软化的蜗壳、前庭膜、盖膜，把基底膜从蜗轴分离下来，按顶、中、底回分为三段。

1.5 免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜拍摄

将各组各时间点解剖完成的基底膜进行免疫荧光染色。本实验使用Myosin7A Polyclonal Antibody（Invitrogen，PA1-936）搭配对应的 Alexa Fluor® 488 goat anti-rabbit IgG(H+L)荧光二抗（Life Technologies，A11008）对内、外毛细胞胞质进行特异染色，使用含有DAPI的荧光封片剂（中杉金桥，ZLI-9557）进行基底膜细胞核染色并封片，避光，-20℃冰箱保存。

选择405nm和488nm波长的激发光，激发荧光信号显示为蓝色（细胞核）和绿色（内、外毛细胞胞质）。应用Zeiss倒置共聚焦显微镜对标本进行逐层扫描，设置扫描层厚1μm，获取图层、叠加末置后导出最终的结果图片。

1.6 统计学方法

使用SPSS 18.0（美国芝加哥SPSS公司）进行统计分析。采用t检验方法评估实验组与对照组间的差异，将P＜0.05或P＜0.01视为差异显著或极显著。

2 结果

2.1 ABR检测结果

本实验将各噪声处理组与对照组进行t检验统计分析，结果显示（见图1-3）：100dB SPL白噪声组（100dB）在噪声暴露后第1天仅有16k、24k阈值明显升高，且于第7天继续轻度升高，于第14天基本恢复正常阈值水平，表现为“暂时性阈移”；虽然Click和4k、8k频率均未表现出阈值升高现象，但从I波幅值统计显示，噪声暴露后第1天、第14天各频率I波幅值均有下降，且大部分差异明显（P＜0.01，P＜0.05）。120dB SPL白噪声组（120dB）噪声暴露后各频率均显示阈值明显升高，随着时间略有恢复，但无法达到正常听阈水平，这种听阈不完全恢复的状态被定义为“轻度永久性阈移”；图中可以发现，16k和24k频率的阈值恢复明显更差，提示高频段听力受损更严重；从I波幅值和潜伏期统计显示，各频率I波幅值明显降低、潜伏期延长，且随着时间延长未见好转。116dB SPL，8-16kHz窄带噪声组（116dB 8-16kHz）噪声暴露后阈值明显升高或大部分阈值无法引出，各频率I波幅值明显降低、潜伏期延长，听力无法恢复，这种听阈不恢复的状态被定义为“重度永久性阈移”。

图1 噪声暴露后ABR变化分析。各实验组噪声暴露4h后，不同频率Click(A)、4k(B)、8k(C)、16k(D)和24k(E)的阈值变化。数值=平均值±标准差(*P＜0.05,**P＜0.01)。Fig.1 Analysis of ABR changes after noise exposure.The threshold values of Click(A),4k(B),8k(C),16k(D)and 24k(E)in each experimental group after 4 hours of noise exposure.Values are ±s.*P＜0.05,**P＜0.01,compared with the Ctrl group.

图2 噪声暴露后I波幅值变化分析。各实验组噪声暴露4h后，不同频率Click(A)、4k(B)、8k(C)、16k(D)和24k(E)的I波幅值变化。数值=平均值±标准差(*P＜0.05,**P＜0.01)。Fig.2 Analysis of amplitude changes after noise exposure.The amplitude values of Click(A),4k(B),8k(C),16k(D)and 24k(E)in each experimental group after 4 hours of noise exposure.Values are ±s.*P＜0.05,**P＜0.01,compared with the Ctrl group.

图3 噪声暴露后I波潜伏期变化分析。各实验组噪声暴露4h后，不同频率Click(A)、4k(B)、8k(C)、16k(D)和24k(E)的I波潜伏期变化。数值=平均值±标准差(*P＜0.05,**P＜0.01)。Fig.3 Analysis of latency changes after noise exposure.The latency values of Click(A),4k(B),8k(C),16k(D)and 24k(E)in each experimental group after 4 hours of noise exposure.Values are ±s.*P＜0.05,**P＜0.01,compared with the Ctrl group.

2.2 免疫荧光染色结果

对基底膜细胞核和内、外毛细胞胞质进行特异染色后可明显观测到各实验组内、外毛细胞，通过激光共聚焦显微镜拍摄并merge处理后分别得出各组的毛细胞图片,分为顶回（图4A）、中回（图5A）、底回（图6A）分别进行展示，并定量计数了各组耳蜗顶回（图4B）、中回（图5B）、底回（图6B）内、外毛细胞的数量，实验组和对照组进行t检验统计，得出结果如下：100dB组和120dB组噪声暴露后未见内毛细胞缺损情况。唯有116dB 8-16kHz组可见内毛细胞大量减少，内毛细胞缺损于顶、中、底回均有出现，但以中回最为严重，第1天、第7天、第14天各时间节点数据与Ctrl组统计显示差异均显著（P＜0.05或P＜0.01）；直观展示见荧光图片，可见中回视野内仅残余数个内毛细胞甚至完全缺失；另外，观察第1天、第7天、第14天数据发现内毛细胞损伤或许会随着时间逐渐加重。外毛细胞结果显示100dB组噪声暴露后未见明显损伤，荧光图片展示极个别点状缺失无统计学意义（P＞0.05）。120dB组噪声暴露会导致散在点片状外毛细胞缺损情况，多于中、底回出现，且本实验结果显示中、底回部分时间点数据有统计学意义（P＜0.05）。116dB 8-16kHz组会导致外毛细胞大量丢失，全耳蜗均有波及，且于第1天即开始出现，共聚焦显微镜观察多于顶回见少许残留外毛细胞且排列紊乱，与Ctrl组统计显示顶、中、底回各时间点差异均极其显著（P＜0.01）。总体来说噪声致毛细胞缺损多于中底回最为严重，此结果与测听结果及既往研究一致[17]。

图4 噪声暴露后顶回毛细胞损伤分析。A各噪声暴露后，顶回内、外毛细胞荧光图；B顶回内、外毛细胞损伤统计。数值=平均值±标准差(*P＜0.05,**P＜0.01)。标尺：20μm。Fig.4 Analysis of hair cell damage in the cochlear apex after noise exposure.A:Fluorescence image of inner and outer hair cells in the cochlear apex after noise exposure;B:The statistical analysis of inner and outer hair cell damage in the cochlear apex.Values are ±s.*P＜0.05,**P＜0.01,compared with the Ctrl group.Scale bar:20 μm.

图5 噪声暴露后中回毛细胞损伤分析。A各噪声暴露后，中回内、外毛细胞荧光图；B中回内、外毛细胞损伤统计。数值=平均值±标准差(*P＜0.05,**P＜0.01)。标尺：20μm。Fig.5 Analysis of hair cell damage in the cochlear middle after noise exposure.A:Fluorescence image of inner and outer hair cells in the cochlear middle after noise exposure;B:The statistical analysis of inner and outer hair cell damage in the cochlear middle.Values are ±s.*P＜0.05,**P＜0.01,compared with the Ctrl group.Scale bar:20 μm.

图6 噪声暴露后底回毛细胞损伤分析。A各噪声暴露后，底回内、外毛细胞荧光图；B底回内、外毛细胞损伤统计。数值=平均值±标准差(*P＜0.05,**P＜0.01)。标尺：20μm。Fig.6 Analysis of hair cell damage in the cochlear base after noise exposure.A:Fluorescence image of inner and outer hair cells in the cochlear base after noise exposure;B:The statistical analysis of inner and outer hair cell damage in the cochlear base.Values are ±s.*P＜0.05,**P＜0.01,compared with the Ctrl group.Scale bar:20 μm.

3 讨论

强噪声刺激可导致听觉神经系统不可逆性损伤，然而目前噪声性聋的治疗还没有特效药物。听觉障碍是重要致残因素，鉴于目前噪声污染的严重性，由此导致的NIHL已被列入重大公共卫生问题。针对NIHL的防治，临床上多采用治疗感音神经性聋的方案治疗，既往也有众多抑制氧化应激的药物用于NIHL的防治，但其作用都较为有限，目前还没有哪一种药物被认为是治疗NIHL的特效药。考虑到NIHL对个人及社会发展带来的极大压力，因此，深入研究NIHL的病理机制，探索更加有效的治疗切入点迫在眉睫。

有文献将噪声性聋定义为85dB SPL强度以上噪声[19]引起内耳毛细胞损伤为主的一种感音神经性聋。根据噪声性质及听功能损伤过程，噪声性听力损伤可细分为长期连续噪声性聋和强脉冲爆震性聋。强脉冲爆震导致的听力损伤常见于特殊职业人员，如军人进行枪炮射击导致的爆震性听力损伤事件，目前仍然以物理降噪防护为主。本研究重点关注不同类型、不同强度的连续噪声致听力损伤特点，着重于暂时性阈移和永久性阈移（轻度、重度）三种损害模型中毛细胞损伤的作用占比，以便为后续建立听觉保护相关药物评价体系，奠定一定的理论及实验基础。

目前连续噪声致聋，相关动物模型以白噪声和带宽噪声为主[13,20-22]，一般噪声介导毛细胞死亡严格遵循暴露噪声的频率及频带部位及范围的能量原则。因此，同等强度的窄带噪声其导致的特征性频段的毛细胞损伤会更加严重。本研究分析发现，100dB SPL白噪声处理组未见内、外毛细胞损失，听功能检测表现为可以自愈的暂时性听力损伤现象，但I波幅值显著降低且潜伏期延长，既往研究提示，此现象与该噪声强度下带状突触的急性损伤有关，临床可表现为言语识别能力的下降，即出现“隐匿性听力损失”[12,23-25]。而120dB SPL白噪声则导致听阈永久性升高，但并不会出现大量毛细胞死亡现象，这预示着白噪声介导的永久性听力损伤的早期阶段，可能并不是由于毛细胞缺损所致，这预示着这类永久性听力损伤可能与隐匿性听力损伤状态下存在类似的病理机制，至少既往研究表明，轻、中度的永久性听力损失患者在嘈杂环境中的言语识别能力同样显著降低[26,27],这预示着，通过服用听觉保护药物（比如保护突触功能），可能对于高强度白噪声介导的永久性听力损伤，同样具有保护效果；因此这类永久性听力损伤患者，在刚刚接触噪声后，可能存在一个潜在的治疗窗口期，或可为这类噪声性聋的干预治疗提供全新思路。然而，研究发现近似强度的窄带噪声（116dB SPL，8-16kHz）则可以导致大量外毛细胞缺损，且阈值升高频率与毛细胞缺损部位具有显著关联性，我们认为由于同等强度窄带噪声能量更为集中于特定频谱范围，所以对相应频段毛细胞的打击强度更高，因此导致更为严重的毛细胞损伤效果，这提示我们毛细胞缺损是重度听力损失的主要原因，而这类损伤情况的保护作用及受损毛细胞再生研究仍然面临较大挑战。此外，本研究同时发现内毛细胞在同等噪声打击状态下，对噪声刺激更加耐受，可能与内、外毛细胞结构及排列特性有关，以往研究也证明只有当高强度噪声长时间暴露后，才可能造成内毛细胞病变[28]。

本研究重点关注了各类噪声性损伤模型中小鼠内、外毛细胞的损伤程度，对于后续听觉生理、噪声性聋分子机制及相关听觉保护药物研发及评价工作，奠定了必要的理论及动物模型基础。