贾新转 刘二缓 王聪敏 张 娜 魏 兰

(1 河北医科大学第四医院生殖医学科，河北省石家庄市 050011，电子邮箱：9376868@qq.com；2 河北省深州市医院手术室，深州市 053800；3 河北省胸科医院胸外科，石家庄市 050041)

移植胚胎的质量是影响辅助生殖技术治疗效果的主要因素之一。尽管大多数成熟卵母细胞可以受精，但只有一小部分可发育到囊胚阶段[1]。如何确定卵母细胞及胚胎的发育潜力仍是目前研究的热点。由于卵泡液存在于卵泡腔内，并包绕于卵母细胞周围，更多学者倾向于在卵泡液中寻找评估卵母细胞质量的标志物[2]。近年来关于混合卵泡液中维生素D水平的研究结果显示，卵泡液中高维生素D水平不利于体外受精结局[3]；卵泡液中低维生素D水平与较高的流产率相关[4]；进行体外受精的女性补充维生素D后可改善子宫内膜质量，提高临床妊娠率[5]；多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)伴有不孕的患者补充维生素D可改善胚胎质量，提高临床妊娠率[6]。但关于单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平的研究较少。本研究探讨PCOS伴不孕患者单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与胚胎发育及新鲜胚胎周期临床结局的相关性，为临床评估卵母细胞受精、胚胎发育情况及临床结局提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020年1～9月在河北医科大学第四医院生殖医学科初次就诊且需进行体外受精-胚胎移植(invitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)治疗的97例PCOS患者作为研究对象。纳入标准：(1)根据2004年鹿特丹标准[7]诊断为PCOS；(2)PCOS伴有原发性不孕(即有正常性生活的女性，同居1年从未妊娠)，且需行IVF-ET(新鲜胚胎周期)治疗；(3)年龄25～30岁，体质指数18.5～23.9 kg/m2。排除标准：(1)配偶精液异常；(2)患有子宫内膜异位症或其他子宫器质性疾病；(3)自身或配偶有吸烟、饮酒等不良嗜好；(4)患有高血压、糖尿病、自身免疫性疾病、甲状腺功能异常、恶性肿瘤；(5)患有重要脏器(如心、脑、肺、肝、肾等)疾病；(6)入组前3个月内服用过维生素制剂；(7)新鲜胚胎周期中行多胚胎移植。本研究通过河北医科大学第四医院医学伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 卵巢刺激方案 于月经周期第2天或第3天给予卵巢刺激方案治疗。皮下注射促性腺激素[重组人促卵泡刺激素注射液(商品名：果纳芬，厂家：默克雪兰诺有限公司，规格：450 IU/支，进口药品注册证号：S20160040)]，150～225 IU/次(根据患者体质指数调整剂量。体质指数为18～20 kg/m2给予150 IU/次，20～24 kg/m2给予225 IU/次)，1次/d ，连续给药至艾泽注射日。给予重组人促卵泡刺激素注射液治疗3～4 d后进行经阴道彩超检查卵泡直径，采集清晨空腹静脉血3 mL检测雌二醇水平，根据检测出的卵泡直径决定下次检查的时间(卵泡直径≥12 mm，下次检查时间为1～2 d后；卵泡直径<12 mm，下次检查时间为3～4 d后)。当第1个卵泡直径达到12 mm或雌二醇水平达到200 pg/mL时，皮下注射醋酸加尼瑞克注射液(商品名：晴乐，厂家：正大天晴药业集团股份有限公司，规格：0.25 mg/支，国药准字H20183025)抑制垂体，0.25 mg/次，1次/d，连续用药至艾泽注射日。用药后1～2 d进行经阴道彩超观察卵泡直径，根据检查结果决定下次检查时间(卵泡直径<14 mm，下次检查时间为本次检查后2 d，卵泡直径≥14 mm，下次检查时间为本次检查后1 d)。当至少有1个卵泡直径达到18 mm或2个卵泡最大直径达到16 mm时，给予皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素(商品名：艾泽，厂家：默克雪兰诺有限公司，规格：250 μg/支，进口药品注册证号：S20130091)250 μg。

1.3 卵泡液的收集 皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素(艾泽)36 h后，进行经阴道超声引导下取卵：常规消毒、铺无菌单，经阴道超声引导下，将21 G单腔取卵针连接到封闭真空系统，选择最大直径≥16 mm的卵泡进行取卵，收集单个卵泡内容物至单独的试管内，避免冲洗液和血液污染卵泡内容物，将卵泡内容物经37℃恒温传送窗口传入胚胎实验室中，立即检查卵泡内容物中是否存在卵母细胞，当存在卵母细胞时，将卵母细胞置于培养皿中，将剩余卵泡液于37℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液置于-80℃冰箱避光保存待测。

1.4 卵泡液中脂溶性维生素水平的测定 于37℃恒温下测定1.3中成熟卵母细胞的卵泡液中脂溶性维生素水平。委托北京和合医学检验所检测维生素A、维生素E水平，检测方法为高效液相色谱法，检测仪器为日本岛津公司生产的高效液相色谱仪(型号LC-20A)；采用酶联免疫吸附法检测维生素D、维生素K水平，检测仪器为瑞士澳斯邦公司生产的JC028酶标仪，试剂盒购自英国IDS公司(批号：AC-57SF1)、上海科顺生物科技有限公司(批号：KS18407)。

1.5 胚胎质量及形态学等级的评估 依据Istanbul共识[8]评估胚胎质量。培养第3天(D3)的优质胚胎指有8个对称的、无碎片的卵裂球；培养第5天(D5)的优质胚胎指已经完全扩展(4级)到孵化(5级)的胚胎，且具有高质量的内细胞团(1级)和滋养外胚层(1级)。胚胎形态等级评分[3]：D3根据卵裂球数量(4～8个卵裂球分别计4～8分)、碎片等级(1级为碎片不超过5%，2级为碎片占6%～10%，3级为碎片占11%～15%，4级为碎片占16%～50%，分别计4～1分)和卵裂球是否匀称(1级为卵裂球匀称或大致匀称，2级为卵裂球不匀称，分别计2分、1分)对胚胎形态学等级进行评分；D5根据囊胚扩展分级(1～6级，分别计1～6分)、内细胞团质量(1～3级，分别计3～1分)和滋养外胚层细胞质量(1～3级，分别计3～1分)对胚胎形态学等级进行评分。D3、D5胚胎形态学等级评分为各项评分之和。

1.6 临床妊娠判定 于新鲜胚胎周期单胚胎移植后35 d行B超检查可见子宫内孕囊判定为临床妊娠。临床妊娠率=临床妊娠周期数/胚胎移植总周期数×100%。

1.7 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以(x±s)表示；非正态分布的计量资料以[M(P25，P75)]表示。采用Spearman相关分析卵泡液中脂溶性维生素水平与D3、D5胚胎形态学等级评分的相关性；采用多因素Logistic模型回归分析卵泡液中脂溶性维生素水平与卵母细胞受精状况、D3和D5胚胎发育情况，以及新鲜胚胎周期临床结局的相关性。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象的一般资料、卵泡液中脂溶性维生素水平、胚胎发育及临床结局情况 共收集到97名患者的成熟卵母细胞1 036个。1 036个成熟卵母细胞的单个卵泡卵泡液中维生素A水平为656.27(628.50，688.00)ng/mL，维生素D水平为21.39(17.22，22.91)ng/mL，维生素E水平为3 129.55(3 052.26，3 193.00)ng/mL，维生素K水平为0.72(0.71，0.73)ng/mL。831个成熟卵母细胞成功受精，发育至D3的胚胎718个(其中优质胚胎236个，非优质胚胎482个)，发育至D5的胚胎397个(其中优质胚胎158个，非优质胚胎239个)。新鲜胚胎周期(单胚胎移植)中D3移植胚胎82个，D5移植胚胎15个，临床妊娠42例，临床妊娠率为43.30%(42/97)。见表1。

表1 研究对象的一般资料、卵泡液中脂溶性维生素水平、胚胎发育及临床结局情况

2.2 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与其对应的卵母细胞受精状况的相关性的多因素Logistic回归分析 以卵母细胞受精状况为因变量(未受精=0，受精=1)，以单个卵泡卵泡液中维生素A、维生素D、维生素E、维生素K水平为自变量(均以实测值纳入)，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，单个卵泡卵泡液中维生素A、维生素E水平与其对应的卵母细胞成功受精均相关(均P<0.05)，而维生素D、维生素K水平与其对应的卵母细胞受精与否均无相关性(均P>0.05)。见表2。

表2 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与其对应的卵母细胞受精情况的相关性的多因素Logistic回归分析

2.3 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与D3胚胎发育情况的相关性的多因素Logistic回归分析 以D3胚胎发育情况为因变量(未能发育至D3=0，发育至D3=1)，以单个卵泡卵泡液中维生素A、维生素D、维生素E、维生素K水平为自变量(均以实测值纳入)，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，单个卵泡卵泡液中维生素D水平与其对应的胚胎能否发育至D3相关(P<0.05)，而维生素A、维生素E、维生素K水平与胚胎能否发育至D3均无相关性(均P>0.05)。见表3。

表3 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与D3胚胎发育情况的相关性的多因素Logistic回归分析

2.4 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与D5胚胎发育情况的相关性的多因素Logistic回归分析 以D5胚胎发育情况为因变量(未能发育至D5=0，发育至D5=1)，以单个卵泡卵泡液中维生素A、维生素D、维生素E、维生素K水平为自变量(均以实测值纳入)，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，单个卵泡卵泡液中维生素D水平与其对应的胚胎能否发育至D5相关(P<0.05)，而维生素A、维生素E、维生素K水平与胚胎能否发育至D5均无相关性(均P>0.05)。见表4。

表4 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与D5胚胎发育情况的相关性的多因素Logistic回归分析

2.5 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与D3、D5胚胎形态学等级评分的相关性 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素A(rs=0.012，P=0.864)、维生素D(rs=0.036，P=0.592)、维生素E(rs=0.074，P=0.275)、维生素K(rs=0.084，P=0.213)水平与D3胚胎形态学等级评分均无相关性(均P>0.05)。单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素A(rs=0.099，P=0.189)、维生素D(rs=0.030，P=0.692)、维生素E(rs=0.088，P=0.239)、维生素K(rs=0.046，P=0.544)水平与D5胚胎形态学等级评分均无相关性(均P>0.05)。

2.6 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与临床结局的相关性的多因素Logistic回归分析 以新鲜胚胎周期的临床结局为因变量(未妊娠=0，妊娠=1)，以单个卵泡卵泡液中维生素A、维生素D、维生素E、维生素K水平为自变量(均以实测值纳入)，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，单个卵泡卵泡液中维生素D水平与临床妊娠相关(P<0.05)，而维生素A、维生素E、维生素K水平与新鲜胚胎周期临床妊娠均无相关性(均P>0.05)。见表5。

表5 单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与临床结局的相关性的多因素Logistic回归分析

3 讨 论

脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K，在机体中发挥重要的生理功能，可作为激素前体或抗氧化剂参与人类生殖过程[9]。现有的研究大多集中于分析混合卵泡液中维生素水平对卵母细胞和胚胎质量的影响[3-4，9-14]，但并未有研究对单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平与卵母细胞的受精状况、胚胎发育情况及质量、临床结局的关系进行分析。检测卵泡液中脂溶性维生素水平是分析卵母细胞微环境与其受精和发育潜能之间的相关性的最佳方法。故本研究旨在评估单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平对卵母细胞受精、胚胎发育及新鲜胚胎周期临床结局的影响。

3.1 维生素A及维生素E 在健康的胚胎中，由于新组织的形成，活性氧产生增多，需要更高水平的抗氧化剂以维持平衡。已有研究证实卵泡液中存在活性氧和抗氧化物[15-17]，维生素A及维生素E均为机体抗氧化防御系统的非酶类强抗氧化剂，可改善氧化应激损伤、胰岛素抵抗及糖脂代谢异常[9]。维生素A可减轻滋养细胞氧化应激，并可作为细胞外基质蛋白的辅助因子，调节胚胎形成、胎儿生长及妊娠进展过程[18]。过量的维生素E可拮抗其他脂溶性维生素的吸收和功能[19]。研究显示，维生素A、维生素E有助于促进卵母细胞发育，提高胚胎质量[11-13]。本研究结果显示，单个卵泡卵泡液中维生素A、维生素E水平均与其对应的卵母细胞成功受精相关(均P<0.05)，单个卵泡卵泡液中维生素A及维生素E水平升高是其对应的卵母细胞成功受精的保护因素，但其与D3、D5的胚胎发育情况、胚胎形态学等级评分及新鲜胚胎周期的临床结局均无关(均P>0.05)，与既往研究[11-13]结果不完全一致，这可能是由于既往研究以混合卵泡液为标本进行检测，而本研究是测定单个卵泡卵泡液中的维生素A及维生素E水平。

3.2 维生素D 在本研究中，单个卵泡卵泡液中维生素D水平与其对应的卵母细胞受精与否无相关性(P>0.05)，与Firouzabadi等[20]的研究结果一致。但另有研究报道，卵泡液中维生素D水平与受精率呈负相关[4]，而血清维生素D水平高的女性受精率高[21]。这可能是由于不同研究中卵泡液的收集方法或检测标本不同所致。

维生素D作为转录因子，可调节CYP19基因的表达，而CYP19基因可编码芳香化酶，后者是雌激素转化过程中的主要酶[22]，维生素D缺乏可导致雌激素水平降低。另一方面，维生素D可调节PCOS女性的血清雄激素水平[23]，PCOS女性睾酮水平升高与受精率下降、胚胎发育率下降及流产率升高有关，高雄激素水平可能对卵泡生成和子宫内膜功能产生不利影响[24]。本研究结果显示，单个卵泡卵泡液中维生素D水平与其对应的胚胎能否发育至D3、D5及新鲜胚胎周期的临床妊娠情况均相关(均P<0.05)，而与D3、D5的胚胎形态学等级评分均无相关性(均P>0.05)，单个卵泡卵泡液中维生素D水平升高是胚胎发育至D3、D5及新鲜胚胎周期临床妊娠的保护因素(均P<0.05)。在本课题组前期关于继发性不孕女性(输卵管因素、子宫内膜异位症、PCOS、卵巢储备不足所致)的研究中，混合卵泡液中维生素D高水平组IVF-ET的正常受精率、D3优质胚胎形成率、D5优质胚胎形成率、临床妊娠率均高于维生素D低水平组[25]。本研究以单个卵泡卵泡液为标本测定脂溶性维生素水平，且在新鲜胚胎周期进行单胚胎移植，再次验证了卵泡液中高维生素D水平在卵泡发育及临床妊娠中具有保护作用。另有研究报告，卵泡液中维生素D水平可预测体外受精结局，充足的维生素D水平在子宫内膜容受性中发挥有益作用[26]；维生素D可通过子宫内膜的局部效应在体外受精和妊娠过程中发挥重要作用[27]。

3.3 维生素K 维生素K除参与凝血外，还具有改善骨质疏松、血管钙化、胰岛素敏感性的作用[27-29]。关于维生素K与生殖的关系的研究较少，有动物试验表明添加维生素K2有利于牛体外胚胎发育[14]。在本研究中，单个卵泡卵泡液中维生素K水平是唯一与卵母细胞受精、胚胎发育及临床妊娠均无关的脂溶性维生素。但目前国内外关于卵泡液中维生素K水平与临床妊娠结局的相关研究较少，今后有待扩大样本量进一步探讨。

综上所述，PCOS伴不孕女性单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素中，维生素A、维生素E水平升高是卵母细胞成功受精的保护因素，维生素D水平升高是胚胎发育及新鲜胚胎周期临床妊娠的保护因素，而单个卵泡卵泡液中脂溶性维生素水平均与胚胎形态学等级评分无关。