李嘉铃 黄燕玲 董柏青，2 陈钦艳 胡莉萍 王 超 苏永健 李 海,2

(广西中医药大学1 公共卫生与管理学院流行病学教研室，2 广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁市 530200，电子邮箱：454978268@qq.com；3 广西壮族自治区疾病预防控制中心广西病毒性肝炎防治研究重点实验室，南宁市 530029；4 广西中医药大学基础医学院生物化学教研室，南宁市 530200)

乙型病毒性肝炎(以下简称“乙肝”)是一种由HBV感染引起的传染性疾病，是严重的公共卫生问题之一。据统计，广西是我国乙肝高发地区之一。其人群HBV携带率[1]和5岁以下儿童HBV感染率[2]均高于全国平均水平，目前控制HBV感染流行最有效的措施是及时进行乙肝疫苗的接种，但仍有少量接种者存在乙肝疫苗低/无应答现象[3-4]，近年来研究者们开始从遗传因素上寻找导致该现象的原因。DNA甲基化是DNA化学修饰的一种形式。既往有学者对HBV基因组和宿主基因组的甲基化与慢性乙肝、肝硬化、肝癌之间的关系进行研究，结果证实一些DNA甲基化与乙肝相关疾病的发生和发展有关[5-6]。甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein，METTL)3与METTL14是N6-甲基腺嘌呤的甲基转移酶的主要组分，与肝癌的相关性较强[7-8]，但METTL3/14基因的甲基化对乙肝疫苗应答水平的影响尚未被阐明。本研究从表观遗传学角度，探讨METTL3/14基因的CpG位点甲基化对汉族儿童乙肝疫苗应答水平的影响，以期为研发新型乙肝疫苗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组

1.1.1 研究对象:选择2016年1～12月期间在南宁市妇幼保健院、南宁市第一人民医院和广西壮族自治区妇幼保健院就诊，并已按照免疫规划程序接种乙肝疫苗的263名8～9月龄汉族儿童作为研究对象。纳入标准：(1)儿童出生时已按国家免疫规划接种3剂次乙肝疫苗；(2)儿童及其父母双方均为汉族；(3)乙肝血清学标志物“两对半”检测中，除HBsAb外其余四项(HBsAg、HBeAg、HBeAb、HBcAb)均为阴性；(4)HBV-DNA检测阴性；(5)肝功能正常。排除标准：(1)患有肝脏相关疾病；(2)患有先天缺陷性疾病。本研究方案已获得广西壮族自治区医学伦理审查委员会批准，研究对象的父母均充分知晓本研究的相关事项并签署知情同意书。

1.1.2 研究对象分组:本研究采用非匹配病例对照研究方法，根据文献[9]确定低/无应答组与高/正常应答组的判断标准，即将HBsAb检测结果作为依据进行分组。(1)乙肝疫苗无应答组，HBsAb水平<10 mIU/mL；(2)乙肝疫苗低应答组，10 mIU/mL≤HBsAb水平<100 mIU/mL；(3)乙肝疫苗正常应答组，100 mIU/mL≤HBsAb水平<1 000 mIU/mL；(4)乙肝疫苗高应答组，HBsAb水平≥1 000 mIU/mL。其中，乙肝疫苗无应答组和低应答组合并为低/无应答组，正常应答组和高应答组合并为高/正常应答组。

1.2 相关指标的检测

1.2.1 血样采集:采集研究对象完成乙肝疫苗免疫接种程序8周后的外周血10 mL，其中5 mL使用高速离心机以常温、3 000 r/min的条件离心5 min后分离出血清，用于检测HBV-DNA和乙肝血清学标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，另外5 mL抗凝全血用于检测DNA甲基化水平。

1.2.2 血清相关指标的检测:采用雅培化学发光免疫分析仪(美国雅培公司，型号：AX-SYM i2000)检测乙肝血清学标志物；采用全自动荧光定量PCR仪(Life Technologies Holdings Pte Ltd.，型号：QuantStudio 7 Flex)和HBV核酸测定试剂盒(圣湘生物科技股份有限公司，生产批号：2016010)定量检测HBV-DNA，实验步骤和判断标准均按试剂说明书进行。血清HBV-DNA水平是体现HBV复制活动情况最直接、有效的方式，定量检测血清HBV-DNA水平能有效地监测HBV感染情况。经检测，所有研究对象均无HBV感染情况。

1.2.3 DNA提取和质量检测:使用TRIzol(Thermo Fisher Scientific公司，批号：MAN0016385)法提取外周血DNA，采用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在凝胶图像成像系统中观察清晰的条带有无明显降解和RNA污染情况，以评估基因组DNA的完整性；采用超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司，型号：NanoDrop 2000)检测DNA的质量。所有研究对象样本的DNA浓度≥20 ng/μL，总量≥1 μg，吸光度260/280=1.7～2.0，吸光度260/230≥1.8。

1.2.4 DNA甲基化水平的检测:采用上海天昊科技公司的MethylTarget测序技术检测目的基因区域的甲基化水平。使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(Zymo Research公司，生产批号：D5005)处理样品，以进行DNA变性和亚硫酸氢盐转变，从而将基因组DNA未被甲基化修饰的胞嘧啶转化为尿嘧啶。主要操作过程为：将130 μL CT转换试剂和20 μL DNA样品混匀，然后按98℃ 10 min、64℃ 5 h、4℃保存的步骤进行反应;将处理后的样品加至含600 μL M-Binding Buffer的吸附柱中颠倒混匀，以12 000 r/min离心30 s去滤液；分别加入M-Wash Buffer、M-Desulphonation Buffer混匀离心去滤液，最后得到洗脱后的DNA。对经亚硫酸氢盐转变后的样本进行引物设计和多重PCR反应以扩增目标区域。PCR反应条件为，95℃变性2 min，循环数1×；95℃变性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，循环数11×(-0.5℃/循环)；95℃变性20 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，循环数24×；72℃延伸min，循环数1×；4℃保存，取2 μL PCR产物稀释至60 μL作为下一步Index PCR反应的模板。给每个样本加上不同的Index。Index PCR反应条件为，95℃变性2 min，循环数1×；95℃变性20 s，60℃变性30 s，72℃延伸30 s，循环数11×；72℃延伸3 min，循环数1×；4℃保存。通过2%琼脂糖凝胶检测目标产物纯度，以DNA Marker B(TaKaRa公司，生产批号：3591A)作为参考割胶回收较亮的条带区域获得MethylTarget测序文库。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies公司，型号：HP2100，G2938A)验证文库片段长度，最后采用Illumina HiSeq测序仪(Illumina公司，型号：NextSeq500)进行高通量测序，获得DNA甲基化数据和图谱，得到FastQ数据。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。经正态性检验发现DNA甲基化水平不符合正态分布，以中位数(M)和四分位数间距(QR)表示，组间比较采用Mann-Whitneyu检验；采用非条件Logistic回归模型分析HBsAb滴度与METTL3/14基因的甲基化水平的相关性，并计算比值比(odd ratio，OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 研究对象的基本情况 263名研究对象中，低/无应答组共有104名儿童，其中男童90名、女童14名；月龄为8个月12名、9个月92名。高/正常应答组共有159名儿童，其中男童138名、女童21名；月龄为8个月31名、9个月128名。低/无应答组和高/正常应答组儿童的性别、年龄构成比较，差异均无统计学意义(χ2=0.004、2.910，P=0.953、0.089)。

2.2 低/无应答组和高/正常应答组METTL3/14基因的甲基化水平的比较 低/无应答组METTL3_3基因31位点、66位点的甲基化水平均高于高/正常应答组(均P<0.05)；而两组的METTL3_1、METTL3_2和METTL14基因各CpG位点的甲基化水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 两组间METTL3、METTL14基因各CpG位点的甲基化水平的比较[M(QR)]

2.3 METTL3/14基因甲基化水平与乙肝疫苗应答水平的相关性 将乙肝疫苗应答水平作为因变量(无应答和低应答=1，正常应答和高应答=0)，各位点的甲基化水平作为自变量(均为连续变量)，采用非条件Logistic回归模型进行分析。结果显示，METTL3_1基因28位点，以及METTL3_3基因31、66、141位点的甲基化水平升高是汉族儿童发生乙肝疫苗低/无应答的危险因素，而METTL3_2基因200位点的甲基化水平升高是汉族儿童乙肝疫苗低/无应答的保护因素(均P<0.05)。见表2。

表2 METTL3/14基因甲基化水平与乙肝疫苗应答水平相关性的Logistic回归分析

3 讨 论

HBV长期存在于体内且不加以控制极易导致机体发生慢性HBV感染和炎症反应，从而可加速肝细胞损伤过程并促进肝纤维化，最终进展为肝硬化甚至肝癌[10]。因此，控制乙肝的流行对于减少肝癌的发生，以及降低肝炎相关疾病的病死率，具有重要的公共卫生学意义。接种乙肝疫苗是控制HBV感染和传播的有效途径，乙肝疫苗的问世及推广，降低了我国5岁以下儿童的HBsAg携带率，有效地减少了HBV的传播和流行。随着我国妇幼保健事业的发展，目前乙肝疫苗基本实现全面覆盖，但仍有调查结果提示广西5岁以下儿童的HBV感染率较高，这可能是广西5岁以下儿童对乙肝疫苗低应答甚至无应答所导致[11]。乙肝疫苗低/无应答水平反映机体对HBV可能存在免疫反应缺失，因此这部分乙肝疫苗低/无应答人群依然具有较高的感染HBV的风险。

甲基化主要通过甲基转移酶、去甲基化酶和阅读蛋白酶发挥调控基因表达、调节蛋白质功能等修饰作用，是一个动态可逆的过程[12]。甲基化水平改变不仅会引起机体某些生物功能的紊乱，还能引发相应疾病的发生，并可影响疾病预后、转归。一些学者指出，DNA甲基化与HBV感染及肝癌相关[13-14]，宿主某些特定基因经过DNA高甲基化修饰后甚至可为HBV营造有利的病毒复制环境[15]，全基因组低甲基化和抑癌基因高甲基化是肝癌形成的重要机制[6]。研究表明，METTL3在肝细胞癌组织中的表达高于正常组织，并且METTL3甲基化水平与肝细胞癌的不良预后有关[16-17]。有学者发现，在小鼠中，敲除METTL3基因不仅抑制了肝细胞癌的肺转移，还可抑制细胞转导抑制因子2的分泌和表达，从而有效地控制癌细胞的转移和增殖[18]。METTL3和METTL14作为核心结构载体，共同构成甲基转移酶复合物以诱导甲基化修饰[19]，并依赖于YTHDF2的细胞转导抑制因子2因子转录后沉默介导肝细胞癌的致癌作用[20]。METTL14还通过甲基化调节因子来调控miRNA的表达进程，从而抑制肝细胞癌的发生和发展[21]。

目前有关METTL3和METTL14基因甲基化修饰的研究主要集中在肝细胞癌、其他消化系统疾病、神经系统疾病上，暂未见METTL3和METTL14与乙肝疫苗应答水平之间关系的相关研究报告。本研究结果显示，低/无应答组和高/正常应答组METTL3_3基因的31与66位点甲基化水平存在差异；进一步采用非条件Logistic回归进行多因素分析，控制各CpG位点的甲基化水平的相互影响后发现，METTL3_1基因28位点和METTL3_3基因31、66、141位点的甲基化水平升高可能是汉族儿童发生乙肝疫苗低/无应答的危险因素，而METTL3_2基因200位点的甲基化水平升高可能是汉族儿童发生乙肝疫苗低/无免疫应答的保护因素(均P<0.05)。上述位点的甲基化会对乙肝疫苗应答水平产生影响可能与以下原因有关：METTL3是初级甲基转移酶，其活性位点具有稳定活性位点构象的作用，而酶自身内部结构的差异可能导致METTL3基因发生异常甲基化，使甲基化修饰在基因转录层面调控METTL3表达，因而可能影响了HBsAb水平[22]。甲基化修饰导致METTL3基因表达异常，进而影响了METTL3/14所介导的N6-甲基腺嘌呤修饰过程，使机体的免疫代谢及调节功能发生变化，从而导致接种乙肝疫苗后机体内HBsAb水平降低[23]。

综上所述，METTL3_1基因28位点和METTL3_3基因31、66、141位点的甲基化水平升高可能是汉族儿童发生乙肝疫苗低/无应答的危险因素，METTL3_2基因200位点的甲基化水平升高可能是汉族儿童发生乙肝疫苗低/无应答的保护因素。但本次研究存在样本量过少、研究现场局限在医院、基本资料收集不全等问题，未能筛选出针对所有人群可预警乙肝疫苗低/无应答的生物学标志物。因此今后将继续扩大样本量和研究人群范围，针对不同的基因组调控、蛋白组代谢等各领域进行更为全面的实验研究和机制分析，为制定新的乙肝防治策略、研发新型乙肝疫苗提供更具科学性的理论依据。