张彦骅 李怡林 朱学喆 刘博

【关键词】子宫内膜异位症;肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1;表达;疾病发生;机制

【中图分类号】R711.22 【文献标识码】A 【文章编号】2026-5328（2022）03--03

子宫内膜异位症（EM）是妇科常见疾病之一，发病率10%～15%，其中76%在25～45岁[1]。主要指子宫内膜组织种植于或者浸润于宫体之外的地方，异位内膜可以出现在全身任何部位，一般位于卵巢、宫骶韧带等，其特征是雌激素依赖和炎性介导，其生物学行为与癌症类似，如其细胞具有迁移、侵袭、再发甚至恶变等。EM主要分为三种类型，卵巢型、腹膜型及深部结节型，目前，发病机制尚未完全阐明，主要有以下学说，种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说[2]。子宫内膜异位症的治疗方案，因病情的轻重，患者的年龄和生育情况而有所不同。近年来腹腔镜的广泛应用，已使子宫内膜异位症的治疗有了一种新的选择，但是仍然有内异症治疗效果不佳，反复复发的问题。所有治疗效果不理想的原因主要在于EM的发病原因不清楚[3]。因此，探讨EM的发病机制是目前研究中最亟待解决的问题。lncRNA在妇科疾病中发挥着重要的作用，但是关于其在EM中的承担的具体作用不清楚，另外AFAP1-AS1通过下调，结果发现细胞的形态发生显著的变化，并且得知此变化与EMT时出现细胞形态发生变化具有一致性，但是关于AFAP1-AS1和EMT之间关系研究，其机理并不明确，另外，AFAP1-AS1的下调在体内及体外的结果是否具有一致性[4]，因此，本研究为了验证EM中lncRNA以及探讨EM中的EMT现象，探讨AFAP1-AS1和EMT之间的关系，研究其机理发生的过程，为EM提出新的标记物及EM的治疗提供新的思路。

1. 资料与方法

1.1一般资料

项目通过我院伦理委员会审查，以我院2020.9-2021.2月期间因卵巢子宫内膜异位症在妇一科接受手术治疗的患者30例为研究对象（实验组），收集其异位内膜组织及在位内膜组织，以术后病理科石蜡病检作为判断标准。同时收集同期非子宫内膜异位症患者30例正常内膜组织（对照组）。实验组30例患者年龄36～76岁，平均（55.32±9.41）岁，在病理分级方面，Ⅰ+Ⅱ级17例，Ⅲ级13例;在病理分期方面，Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期10例。对照组30例患者年龄33～71岁，平均（53.65±8.65）岁。两组患者的一般资料比较差异均不显著（P>0.05）。纳入标准：①一般病例资料完善;②入院实验组初步诊断均考虑卵巢子宫内膜异位症且均为初次治疗，对照组为非子宫内膜异位症，且无子宫内膜良性病变或子宫内膜恶性病变的患者[5];③入院后患者均行手术治疗且术后有明确的石蜡病理诊断结果。排除标准：①实验组既有卵巢子宫内膜异位症，同时合并有卵巢其他囊肿的患者。对照组患者有子宫异常出血或有分泌雌激素的卵巢肿瘤或长期服用雌、孕激素史的患者;②术后病理诊断结果缺失。

1.2方法

1.2.1 AFAP1-AS1在異位组织、在位组织及正常组织中的表达

1.2.1.1组织的获取

收集我院30例确诊为EM的患者的异位内膜组织及在位内膜组织，另外取30例正常内膜组织。标本采集以后立即保存在RNAlater保存液，另外收集患者临床资料。

1.2.1.2细胞培养

正常内膜细胞用含10%胎牛血清的培养基培养，EM患者内膜细胞用含10%胎牛血清的MEM培养基培养，培养条件均5%CO2，37℃。

1.2.1.3细胞总RNA抽提

（1）待细胞处于对数生长期时进行抽提;（2）弃培养液，PBS清洗2次，加入2ml Trizol，吹打，混匀，静置孵育;（3）取1ml转移至1.5ml的EP管，加入0.2ml氯仿，震荡，静置;（4）离心，取上层水相约600μl至新的EP管;（5）加0.5ml异丙醇，静置，离心，弃上清;（6）用1ml 75%的乙醇洗涤;（7）离心，弃上清，干燥;（8）加入ddH2O 30μl溶解，水浴10min;（9）根据1OD260相当于40μg/ml，确定RNA量，根据OD260/OD280判断RNA纯度，RNA样品置于-80℃保存。

1.2.1.4组织标本总RNA抽提

（1）取出保存的组织，研磨;（2）移至含1mlTRIzol RNA的EP管，震荡，静置;（3）加入0.2ml氯仿，震荡，静置;（4）离心，吸上清至新的EP管;（5）加0.5ml异丙醇，颠倒，静置;离心，去上清;（6）加入lml 75%乙醇洗涤;离心，弃上清，干燥;（7）加入30μlddH2O进行讲解，水浴;（8）根据1OD260相当于40μg/ml，确定RNA量，根据OD260/OD280判断RNA纯度，RNA样品置于-80℃保存。

1.2.1.5反转录

利用逆转录试剂操作。取0.5μgRNA融于2ul DEPC中，加入转录引物1μl，用DEPC补至5μl，变性，冷却。再加2μl的5XReaction Buffer，0.5μl的RNAse抑制剂，1μ1的dNTP，0.5μ1逆转录酶RTase，1μlDEPC，使总体积为10μ1，混匀。水浴10min，之后42℃，60min，最后70℃，10min，冷却。置于-20℃保存。

1.2.1.6实时荧光定量PCR

（1）引物序列：UCA1（F：CCCGAGGACCGAAGATCAAA;R：GGCATGAGTGCAGTTGAGGA）;HNF1A-AS1（F：TTACAGACCCGGGATAGGTC;R：CTGTTCTCTCAGGTGTCCGG）;MALAT-1（F：AAGTGTGTCCCTTTGCGTCT;R：TATCCTAGCCTGTCTTGAGC）;KLKP1（F：TCACACTTCCATGGTCCAAA;R：CGCCTAATTCCACTCCAAAGG）;AFAP1-AS1（F：TCCTCAGGTGGGCAAGTGACA;R：CGACCGGCTACTGAGAAGGCTT）AFAP1（F：CGATTGAACCCCGCTCGGTC;R：TTAACACCAGCCGGGCGATCC）;ZEB1（F：ATGCGGAGGGTATATAGAGTGT;R：AAGGATAAAGGTCCGATGAGAT）;（2）配置相应反应体系：试剂盒（2×）：5μl;上游引物（10μM）：0.4μl;反向PCR引物（10μM）：0.4μl;cDNA：1μl;ddH2O：3.2μl;（3）反应条件：95℃变形30s，1cycle;95℃变形3s;60℃退火3s，40cycles。

1.2.1.7免疫组化法

（1）取出保存的组织进行固定，制作蜡块，再切片，贴片。（2）烤片：于60℃烤箱中烘烤60min左右。（3）脱蜡、复水：二甲苯Ⅰ（5min），二甲苯Ⅱ（5mim），无水酒精Ⅰ（2mim），无水酒精Ⅱ（2min），95%酒精（2min），85%酒精（2min），70%酒精（2min），50%酒精（2min），30%酒精（2min）。（4）用PBS洗3次，3min/次。（5）修复抗原：切片于pH7.2的柠檬酸钠修复液，高压冒气2min，冷却。（6）所有切片均加入过氧化酶阻断剂，孵育，PBS洗3次，5min/次。（7）除去PBS，所有切片均加入BSA，孵育，PBS洗3次，5min/次。（8）加一抗：除去PBS，所有切片均加入一抗，4℃过夜。孵育，除去多余液体，PBS洗3次，5min/次。（9）加二抗：除去PBS，所有切片均加入二抗，孵育，PBS洗3次，5min/次。（10）加DAB：除去PBS，所有切片均加入DAB显色液，根据显色的情况判断显色的时间，最后用蒸馏水终止。⑾复染：弃蒸馏水，所有切片均加入苏木素，最后用蒸馏水终止显色。⑿脱水：按照以下顺序进行浸泡，无水乙醇30%，50%、70%、80%、95%、100%、100%，均2min，最后放二甲苯溶液中。⒀晾干，加中性树脂，盖玻片封好。⒁拍照。

1.2.2 AFAP1-AS1下调与EMT的关系研究

1.2.2.1细胞分离和培养

（1）组织的获取：取健康在位内膜组织及EM患者异位内膜组织，均培养于含有2%双抗的DMEM/F12培养基中。（2）消化：将组织移至无菌的培养皿，用PBS洗3次，接着放入含有2%双抗的PBS中，剪碎，用PBS洗3次，沉淀，取上清，加入Ⅳ型胶原酶消化液，封管，水浴，消化1h，震摇，直至呈现粘稠状，加DNaseⅠ，消化。（3）分离和纯化：取出上述消化液，依次经过100目和400目筛网过滤。（4）传代培养：观察细胞汇合度，达到80%即可进行传代培养，去除培养基，加PBS洗2次，去除PBS，加胰蛋白酶，消化，显微镜观察，观察细胞的形态是否出现变化，若变化，立即加血清终止，吹打，离心，去除上清，沉淀，于培养箱继续培养。

1.2.2.2细胞冻存和复苏

（1）细胞冻存：观察细胞汇合度情况，达到80%时即可冻存细胞，弃培养基，加PBS洗2次，加胰蛋白酶，于培养箱中培养，消化，观察细胞的形态，若出现变化，加血清立即终止消化，吹打，离心，去除上清，加细胞冻存液，封口，保存，于-80℃冰箱過夜。（2）细胞复苏：取出冻存的细胞，水浴，离心，弃上清，于培养箱中进行培养，24h更换培养基。

1.2.2.3电镜观察

（1）取材。（2）固定：用2.5%戊二醛进行固定，再用缓冲液清洗3次，10min/次。（3）脱水：用乙醇进行脱水，按照以下顺序操作，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，再用叔丁醇进行脱水3次，10min/次，过夜。（4）冷冻干燥。（5）电镜观察。

1.2.2.4 ELISA

（1）样品制备：取患者外周血，离心，保存;取上述保存的组织。（2）取出条板。（3）孔中加入稀释液，封反应孔，孵育。（4）去除反应液。（5）加入生物素化抗体，封住反应孔，孵育。（6）洗板，加入酶结合物稀释液，封反应孔，避光孵育。（7）洗板5次，加入显色底物，避光孵育。（8）加入终止液，混匀，测OD值。

1.2.2.5 Edu

（1）取对数生长期细胞，接种，应用雌激素进行处理。（2）稀释Edu溶液，制作Edu培养基。（3）孵育，弃培养基，PBS清洗2次，5min/次。（4）加入多聚甲醛进行固定，去除固定液。（5）加入甘氨酸，孵育，弃甘氨酸，PBS清洗1次，5min。（6）加入含有TritonX-100的PBS，孵育，再用PBS清洗1次，5min。（7）加入染色反应液，避光孵育，弃染色液。（8）加入含有TritonX-100的PBS，摇床，清洗2次，5min/次。（9）加入甲醇洗2次，5min/次，再用PBS清洗1次，5min。（10）加入Hoechst33342反应液，避光孵育，弃染色液，再用PBS清洗1次，5min。（11）用显微镜观察，拍照。

1.2.2.6MTT

（1）细胞接种，于培养箱中进行培养，（2）加入MTT，培养。（3）吸出培养液，加入DMSO液，振荡，溶解。（4）测OD值，记录，绘制。

1.2.2.7细胞划痕实验

（1）划线，保证没孔最低经过3条线。（2）将对数增长期的细胞接种于6孔板中。（3）划线。（4）用PBS清洗3次，5min/次，加入无血清的培养基，进行药物处理。（5）于培养箱中进行培养，按照0h、24h、48h取样，拍照。

1.2.2.8 Transwell

（1）种悬细胞，调整细胞密度。（2）每个小孔加入细胞悬液。（3）加入胎牛血清，培养24h。（4）取出Transwell小室，用PBS清洗，用95%乙醇固定，取上层，下层进行染色，再用PBS进行清洗。（5）计数：再显微镜下进行计数，计数10个视野，取平均数。

1.2.2.9细胞侵袭实验

（1）取出解冻好的基质胶，振荡，混匀。（2）预冷。（3）包被基底膜：加入Matrigel溶液，风干。（4）水化基底膜：加入BSA的无血清培养基，孵育。（5）结晶紫染色同上述步骤。

1.2.2.10 Western Blot

（1）细胞或组织总蛋白抽提：将异位组织及在位组织标本研磨。每200mg组织或细胞，加入RIPA裂解液，震荡，离心，取上清。利用蛋白定量试剂盒测蛋白质浓度，用PBS调整为4mg/ml，再加入1/5体积缓冲液，煮沸，离心，-20℃保存。（2）电泳：取总蛋白样品，每孔上样15μ1，于12%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，浓缩胶80V，分离胶120V，出凝胶后结束电泳。（3）电转移：依次按Scotch-Brite垫-Whatman滤纸-凝胶-NC膜-Whatman滤纸-Scotch-brite垫的顺序放置，用特制的夹子夹紧，放入塑料支撑体中，然后浸入盛有缓冲液槽中。冰浴，电转移45min，取出NC，以Pre-Stained Protein Ladder条带为参考，切割PVDF膜。（4）封闭：室温下，用5%脱脂奶粉在水平脱色摇床上封闭1h。（5）加一抗加二抗：按照抗体说明书稀释相应抗体。将封闭后的NC膜放入塑料皿中，加入上述抗体，转印，振荡。次日，以TBST漂洗15min×3次。加入羊抗兔，二抗，孵育，用TBST洗膜，15min×3次。（6）发光底物反应：取luminol，A与B液按1：1混匀，滴于NC膜上，并将膜用透明塑料保鲜膜包裹，反应2min。（7）显影曝光：暗室条件下，压片盒中将感光胶片叠于膜上，用压片夹夹紧曝光5min，取出胶片，依次显影、定影，用水冲洗胶片。

1.3观察指标

数据由华大基因对所做出的数据进行分析，获得AFAP1-AS1在异位组织、在位组织中以及正常内膜组织中的表达情况，EMT标志基因及蛋白、转录因子在异位组织及在位组织中的表达情况，结合收集的上述临床资料及实验数据分析AFAP1-AS1在EM患者中的表达情况。分析AFAP1-AS1下调与EMT的关系。

1.5统计学分析

采用SPSS 20.0软件，计数资料分别用%、X2表示、检验，计量资料分别用（x±s）、t表示、检验，用Cox比例风险模型分析影响因素，P<0.05具有统计学意义。

2. 结果

2.1两组lncRNA AFAP1-AS表达比较

观察组患者的lncRNA AFAP1-AS表达高于对照组（t=37.619，P<0.05）。见表1。

2.2实验组lncRNA AFAP1-AS表达与临床病理特征的相关性分析

病理分级Ⅰ+Ⅱ级患者的lncRNA AFAP1-AS高表达率低于Ⅲ级患者（P<0.05），病理分期Ⅰ+Ⅱ期患者的lncRNA AFAP1-AS高表达率低于Ⅲ+Ⅳ期患者（P<0.05），肌层无或浅浸润患者的lncRNA AFAP1-AS高表达率低于肌层深浸润患者（P<0.05），但不同年龄、淋巴结转移、合并糖尿病、高血压患者的lncRNA AFAP1-AS高表达率之间的差异均不显著（P>0.05）。见表2。

3. 讨论

近几年，EM的致病机制中提出了上皮-间质转化学说（EMT）引起人们的关注[6]。EMT的主要特征有细胞黏附分子表达的减少、细胞角蛋白细胞骨架转化为波形蛋白为主的细胞骨架及形态上具有间充质细胞的特征等[7]。通过EMT，上皮细胞失去了细胞极性，失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力等间质表型，抑制细胞的衰老及凋亡的发生，免疫抑制能力提高。

LncRNA是一类长度大于200nt，缺乏显著开放阅读框（ORF）的ncRNA，lncRNA在妇科疾病中发挥着重要的作用，1ncRNA参与相关生物学行为，主要包括基因组印记、修饰染色质等，另外主要在转录开始及终止，运输等过程中发挥着重要的作用。目前文献报道LncRNA不仅与妇科恶性肿瘤的发生有着密切关系，在EM的病灶组织中也有表达。但是关于其在EM中的承担的具体作用不清楚。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1（actin fiber-associated protein 1-antisense RNA1）是新发现的一种1ncRNA，另外，文献中表明[8]，AFAP1-AS1通过下调，结果发现细胞的形态发生显著的变化，并且得知此变化与EMT时出现细胞形态发生变化具有一致性，但是关于AFAP1-AS1和EMT之间关系研究，其机理并不明确，另外，AFAP1-AS1的下调在体内及体外的结果是否具有一致性。

本研究为了验证EM中lncRNA以及探讨EM中的EMT现象，探讨AFAP1-AS1和EMT之间的关系，研究其机理发生的过程，并通过体内实验验证以上得出的结论，结果表明，实验组患者预后的影响因素包括lncRNA AFAP1-AS表达、病理分期（P<0.05）。这就为治疗EM患者提高新的治疗思路。

综上所述，子宫内膜异位症中肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1的表达升高，与疾病发生的机制关系密切。

参考文献：

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[2]欧阳卓，孙晋萍，田秀兰，等.基质细胞衍生因子-1和趋化因子受体-4在子宫内膜异位症患者病灶中的表达及意义[J].中华医学杂志，2018，98（23）：1854-1858.

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[6]杨璐，郭春凤，何艳.LncRNA AFAP1-AS1在子宫内膜癌中的表达及临床病理参数与预后的关系[J].热带医学杂志，2019，19（12）：1463-1467.

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[8]Adam A，Narayanan M，Hachem C.Endoscopic Appearance and Management of Recto-Sigmoid Endometriosis：Case Report[J].2018，11（4）：326-328.

基金项目：甘肃省自然科学基金（20JR10RA422）