蔡美娜 综述，许四宏 审校

1.北京协和医学院，北京 100730；2.中国食品药品检定研究院，北京 102629

狂犬病由狂犬病病毒感染引起，为高度嗜神经性的人畜共患传染病，全球每年约59 000 人死于该病，其中亚洲和非洲占绝大部分［1］。狂犬病病毒主要存在于受感染动物的唾液中，通过受感染动物咬伤或舔舐宿主受损皮肤进行传播。人感染狂犬病病毒后，一旦发病，会出现恐水、焦虑、狂躁、吞咽肌强直、吞咽困难、流涎、失眠、迟缓性麻痹等临床症状，死亡率几乎为100%［2］，全球仅有6 例治愈病例［3］。

狂犬病病毒属于弹状病毒科、狂犬病病毒属成员，成熟的病毒颗粒呈典型的子弹状，头部呈半球形，末端为截面型，直径约75 nm，长100 ~ 300 nm。狂犬病病毒基因组是不分节段的单股负链RNA，全长约12 000，从3′至5′端依次为N、P、M、G 和L 基因。狂犬病病毒糖蛋白（G）作为狂犬病病毒唯一的膜蛋白，是组成病毒囊膜表面的主要蛋白，含2 ~ 4个糖基化位点，通过与靶细胞结合介导病毒侵染，是诱导产生中和抗体的最主要抗原，在机体免疫中起关键作用［4-5］。

狂犬病是一种高致病性传染病，感染后如不及时治疗，经过一定潜伏期即可发病，最终导致死亡。利用WHO 推荐的暴露后预防（post-exposure proph-ylaxis，PEP）法迅速处理患者，可有效阻止疾病发生。PEP 包括3 个步骤：迅速清理伤口，注射抗狂犬病病毒免疫球蛋白（rabies immunoglobulin，RIG），接种狂犬病疫苗［6-7］。

目前，RIG 是通过接种狂犬病疫苗的人或马的血浆获得，称为人RIG（human RIG，HRIG）或马RIG（equine RIG，ERIG）。常规的RIG 具有成本高、供应量有限以及安全性等问题，因此，考虑利用成本低并可大规模生产的单克隆抗体（MAb）来代替RIG。KUZMINA 等［8］经过序列分析发现，针对非重叠表位的2 个或多个MAb 不会出现相同的病毒逃逸突变株，因此建议联合使用针对狂犬病病毒G 蛋白上至少2 个非重叠表位的MAb 来克服当前RIG 存在的缺陷，并同时保持有效交叉保护的广度。鉴于狂犬病病毒G 蛋白是诱导机体产生抗体的主要抗原，本文对G 蛋白的结构以及可用于替代RIG 的具有广谱中和活性的候选MAb 的研究进展作一综述，为单抗鸡尾酒（MAb cocktail）疗法抗体组合的研究提供参考。

1 G 蛋白的结构及抗原表位

G 蛋白属于以同源三聚体形式存在的Ⅰ型跨膜蛋白，由1 575 个碱基组成，可编码524 个氨基酸，其中N 端第1 ~ 19 位氨基酸为信号肽，在病毒转录过程中被切除［9］，切除信号肽的G 蛋白还需经过在粗面内质网、高尔基体和胞质膜上发生糖基化等内在化修饰才能成为成熟的G 蛋白［10］；其中最主要的糖基化位点是第37 和319 位氨基酸上的位点。成熟的G 蛋白不含信号肽，由505 个氨基酸组成，相对分子质量为56 000，等电点为6.7，包括3 个区域（膜外区、跨膜区和膜内区）。膜外区由第1 ~ 439 位氨基酸构成，该区域可识别宿主细胞上的受体，介导病毒膜与宿主膜融合并含有最主要的抗原位点，具有强免疫原性和抗原性。跨膜区由第440 ~ 461 位氨基酸构成，位于病毒颗粒表面，参与G 蛋白嵌入病毒包膜中。膜内区由第462 ~ 505 位氨基酸构成，位于病毒包膜内，可与M 和N 蛋白相互作用。

成熟G 蛋白上主要抗原位点有GⅠ、GⅡ、GⅢ、G5 及Ag［11-12］，其中GⅠ位于第226 ~ 231 位氨基酸残基区段，既包括空间构象抗原位点又包括线性抗原位点；GⅡ是典型的不连续性的空间构象表位，2 个主要抗原位点GⅡa（第34 ~ 42 位氨基酸）和GⅡb（第198 ~ 200 位氨基酸）通过二硫键相互连接；GⅢ作为最主要的抗原位点，位于第330 ~ 338位氨基酸区段，为构象依赖性表位，另外此区域R333 是狂犬病病毒神经毒性相关位点［13］；次要位点aG，位于第342 ~ 343 位氨基酸区段，与GⅢ相邻；G5 位于261 ~ 264 位氨基酸区段，是高度保守的线性表位，免疫原性较弱。见图1。近年来随着分子生物学及计算生物学的发展，G 蛋白上其他抗原表位被分离鉴定出，如第14 ~ 19 位氨基酸区段表位序列为WxxxDI 的N-末端线性表位［14］，围绕第251 位氨基酸残基的GⅤ及GⅥ表位（位于第264位氨基酸）［8］。

图1 狂犬病病毒G 蛋白上抗原位点示意图Fig.1 Antigen epitopes of rabies virus glycoprotein

基于PEP 中RIG 存在的问题，利用易获得、中和效果好的MAb 替代RIG 是理想的选择。由于狂犬病病毒的自然变异性，尤其是在MAb 中和表位存在的变异性，建议至少2 个MAb 同时使用以确保治疗效果等于或强于RIG。在筛选用于鸡尾酒疗法的MAb 时应遵循以下标准［15-16］：①选择的MAb应针对不同的中和表位且表位不重叠；②选择的MAb 要具有高效中和活性和广谱性；③选择的MAb 组合与疫苗联合使用可保护动物免受致死剂量狂犬病病毒的攻击；④选择的MAb 组合对疫苗的干扰作用不应超过当前使用的血清产品。基于以上原则，以下将详细介绍有希望替代RIG 的MAb组合。

2 17C7（Rabishield ／ RAB1 ／ SIIR MAb）

17C7 抗体是第一个无需与其他抗体组合即可替代RIG 的MAb，2016 年在印度注册并于2017年上市［16-17］。SLOAN 等［18］利用狂犬病疫苗（Rab-AvertTM或Imovax®）免疫转基因小鼠（转入人免疫球蛋白基因），共筛选到27 个人源MAb，其中仅17C7 MAb 可中和在美洲、非洲和亚洲等地不同物种中分离出的44 种狂犬病病毒街毒株；并且在PEP动物体内模型中与疫苗联用可保护仓鼠免受致死剂量狂犬病病毒的攻击。17C7 MAb 与G 蛋白亲和力为13 nM，可识别G 蛋白上的空间依赖性位点Ⅲ，其中关键氨基酸残基位点为N336 和R346。WANG等［19］发现，只有在这两个关键氨基酸残基位点同时存在突变时（N336D ／ R346K），17C7 才不表现对狂犬病病毒的中和作用；在GenBank 中共检测到469条完整的狂犬病病毒G 蛋白序列，没有任何1 条G蛋白序列中同时存在第336 和346 位氨基酸的突变。因此，证明此单一MAb 应足够中和所有狂犬病病毒街毒株。

3 CL184

CL184 现已完成临床Ⅰ期和Ⅱ期试验。Ⅰ期临床试验结果表明，该产品安全且具有良好的耐受性，在20 或40 IU ／ kg 剂量的受试者中均产生足够的狂犬病病毒中和抗体（rabies virus neutralizing antibody，RVNA）水平，但Ⅱ期临床试验结果并未对外公布；2011 年该产品退出临床试验［20］。CL184 由CR57和CR4098 这两种人源抗狂犬病病毒的MAb 组成，其中CR57MAb 由DIETZSCHOLD 等［21］在接种狂犬病疫苗的志愿者的B 细胞中分离出来，之后，MARISSEN 等［22］利用PER.C6®表达系统将抗体重新表达，形成人源IgG1 型抗体——CR57。利用表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）方法测得CR57 MAb 对G 蛋白结合的亲和力为2.4 nmol／L，可识别G 蛋白上的线性表位Ⅰ，其中关键氨基酸残基为第226、228、229 和230 位。通过对229 条不同来源的狂犬病病毒G 蛋白序列分析显示，位点Ⅰ是高度保守的［15］。另外通过体外中和试验证实，CR57 MAb 可中和24 个狂犬病病毒街毒株，仅存在2 个逃逸株［23］。基于鸡尾酒疗法MAb 选择标准，为了寻找与CR57 MAb 表位不重叠、中和作用互补的MAb，KRAMER 等［24］通过接受狂犬病疫苗免疫的志愿者血细胞中获得的抗体基因构建了噬菌体抗体库；利用灭活狂犬病病毒、纯化狂犬病病毒G 蛋白和PER.C6 细胞表面表达狂犬病病毒G 蛋白进行筛选，最终分离鉴定出39 个对狂犬病病毒具有中和活性的scFv 片段，综合VH 和VL 基因种系及对狂犬病病毒的中和活性，将39 个scFv 片段中21 个转化为全长人IgG1，其中14 个抗体的中和效能指标＞500 IU ／ mg（中和效能＞500 IU ／ mg 时，无论在体外或体内MAb 均能有效中和狂犬病病毒街毒株）。随后，BAKKER 等［23］进一步研究了这些抗体对可逃逸CR57 中和作用的狂犬病病毒街毒株的中和效果，筛选出了CR4098 MAb。CR4098 MAb 与G 蛋白的亲和力为4.5 nmol／L，可识别G 蛋白上的空间构象位点Ⅲ，逃逸位点为N336D，可中和26 个狂犬病病毒街毒中的24 个，未能中和的狂犬病病毒街毒株可被CR57 MAb 有效中和。CHANG 等［25］通过对现有主要的狂犬病病毒G 蛋白序列分析后发现，没有任何1 个狂犬病病毒株会同时出现CR57 和CR4098 结合位点的突变。因此，CL184 可有效中和所有的狂犬病病毒街毒株。GOUDSMIT 等［26］在接受致死剂量狂犬病病毒攻击的仓鼠模型中证明，CL184 和RIG 起到的保护作用以及对疫苗的干扰作用相当。

4 RVC-20 ／ RVC-58

狂犬病病毒属由狂犬病病毒及在蝙蝠体内分离出的狂犬病相关病毒组成，主要分为Ⅰ和Ⅱ两个遗传谱系，还包括几个新发现未分类的病毒（见表1［27］）。目前广泛流行的狂犬病主要由遗传谱系Ⅰ中的狂犬病病毒引起。虽然大多数狂犬病相关病毒与人类死亡无关，但全部能够在动物及人类中引起致命的神经系统疾病。近年来，狂犬病相关病毒如EBLV1、EBLV2、ABLV、IRKV、DUVV 和MOKV 等引起了零星人类狂犬病病例，但现有商业化的RIG 对狂犬病相关病毒的中和活性有限［28］；同样，上文提到的2种抗狂犬病病毒MAb CL184 和RAB1 也无法中和大多数狂犬病相关病毒。DE BENEDICTIS 等［29］在接受疫苗免疫的志愿者记忆B 细胞中分离鉴定出对狂犬病病毒具有广谱中和活性抗体——RVC-20 和RVC-58，将2 个抗体联合使用表现出比CL184 和RAB1 更高、更广谱的体外中和活性，不仅可中和现有的35 种狂犬病病毒，还可中和包括EBLV1、EBLV2、ABLV、IRKV、DUVV 和MOKV 等在内的25 种狂犬病相关病毒。RVC-20 MAb 识别狂犬病病毒G 蛋白上的抗原位点Ⅰ，与同识别位点Ⅰ的CR57 MAb 相比，RVC-20 MAb 具有更高、更广谱的中和活性；RVC-58 识别位点为Ⅲ，与之前报道的CR4098 MAb 识别表位部分重叠，CR4098 MAb 不具备中和大部分狂犬病相关病毒的能力，但RVC-58 可中和遗传谱系Ⅰ中所有的狂犬病相关病毒［25］。在受到致死剂量狂犬病病毒攻击的叙利亚仓鼠模型中，0.045 mg ／ kg剂量的RVC-20 与0.045 mg ／ kg 剂量的RVC-58 联合使用，在PEP 中起到与标准剂量HRIG（20 IU／kg）相同的保护作用，且不会干扰狂犬病疫苗接种后在动物体内诱发的RVNA 的产生。综上所述，RVC-20和RVC-58 MAb 用做狂犬病的鸡尾酒疗法，具有较好的应用前景。

表1 狂犬病病毒属病毒分类Tab.1 Classification of Lyssaviruses

5 SYN023

SYN023 因其具有的高效能及广谱中和活性成为替代RIG 的候选者之一，是由CHAO 等［30］于2017 年提出的抗体组合。在动物体内的试验结果表明，SYN023 对10 株北美和15 株中国流行的狂犬病病毒的中和能力优于HRIG，另外，在利用Tadaridabrasiliensis（一种在蝙蝠体内分离出的狂犬病病毒）攻击叙利亚仓鼠的模型中，SYN023 的剂量为0.03 mg／kg 时能够提供与标准剂量HRIG（20 IU／kg）相同的保护作用。

SYN023 是由CTB011 MAb 与CTB012 MAb 按1 ∶1 比例组合而成。CHAO 等［30］首先利用狂犬病疫苗免疫BALB ／ c 小鼠获得MAb 的杂交瘤，经过与狂犬病病毒G 蛋白结合活性及对CVS-11 中和活性的双重筛选，获得5 个MAb，再经竞争ELISA 确定了抗体组合——3D11E3 ／ 7G11A3。3D11E3 和7G11A3 属于鼠源IgG2a 类抗体，为降低免疫原性，通过CDR 移植进行人源化，分别产生了MAb CTB011和CTB012，均为IgG1 型MAb；人源化MAb 与G 蛋白亲和力分别为0.27 和0.31 nmol ／ L；抗体的中和活性在人源化前后未受影响。为了确定抗体的识别表位，对狂犬病病毒G 蛋白进行了全面的丙氨酸扫描诱变（alanine-scanning mutagenesis），结果显示，CTB011 MAb 识别表位Ⅲ的边缘，关键氨基酸残基为N336、I339、E337 和H370；CTB012 MAb 识别表位属于构象表位，但不属于现已知的任何一个表位，结合的关键氨基酸残基为F2、P25、N26、T171 和E281。经过对83 个狂犬病病毒株和47 个狂犬病相关病毒共130 个毒株G 蛋白序列分析发现，2 个MAb 在G 蛋白上的结合位点均高度保守；另外还发现，CTB012 可能中和多种狂犬病相关病毒（如EBLV1 和EBLV2 等），是RIG 及抗狂犬病病毒MAb CL184 和RAB1 无法比拟的。综上所述，体外中和试验、体内动物试验、大量毒株G 蛋白序列分析等结果以及CTB011 ／ CTB012 具有的较强的补体依赖的细胞毒作用（complement dependent cytotoxicity，CDC），足以证明了SYN023 成为狂犬病治疗生物制剂的潜力。

6 NM57S ／ NC08

NM57S ／ NC08 是由我国华北制药集团公司（North China Pharmaceutical Corporation，NCPC）与美国生物技术公司（Molecular Targeting Technologies，MTTI）合作在中国开发的，用于狂犬病暴露后治疗的人抗狂犬病病毒MAb 产品［25］。NM57S ／ NC08 是最初在美国托马斯·杰斐逊大学开发的2 种MAb，其中NM57S 和NC08 MAb 分别识别G 蛋白上的抗原位点Ⅰ、Ⅱ，二者体外可中和多种狂犬病病毒株，并可在动物功效模型中提供有效的保护作用。现已完成Ⅰ、Ⅱ期临床试验，于2018 年3 月正式开启Ⅲ期临床试验［25，31-32］。

7 Rabimabs（62-71-3 ／ M777-16-3）

世界卫生组织狂犬病协作中心（WHO Collaborating Centres for Rabies，WHO RCC）鉴定了5 种鼠源MAb，其中E559、M727-5-1、M777-16-3 和1112-1能识别G 蛋白的抗原位点Ⅱ，62-71-3 识别抗原性位点Ⅰ［29］。根据鼠源MAb 的中和效价、结合特异性以及对狂犬病病毒街毒株的中和效果和广谱性等筛选标准，共获得3 种MAb 鸡尾酒组合，即62-71-2 ／E559、62-71-3 ／ M727-5-1 和62-71-3 ／ M777-16-3。在动物体内，3 组鼠源MAb 构成的鸡尾酒均具有与HRIG 相同的功效，因此可认为是用于PEP 及预防人类狂犬病的潜在廉价生物替代药物。M777-16-3由加拿大动物疾病研究所提供，62-71-3 由美国疾病控制与预防中心提供；Ⅰ、Ⅱ期临床试验均已完成，根据Ⅰ期临床试验结果确定了Ⅲ期临床中Rabimab剂量为40 IU ／ kg，试验在印度13 家诊所展开，目前结果正在分析中［31］。

8 E559 ／ 62-71-3

WHO RCC 鉴定了5 种鼠源MAb 组成的3 种可用于鸡尾酒组合抗体之一，其中识别抗原位点Ⅱ的MAb 中，E559 抗体具有最强中和效价及最广谱的中和活性，因此E559 是最重要的替代RIG 的候选Mab［32］。为了降低鼠源MAb 的免疫原性，VAN DOLLEWEERD 等［33］和BOTH 等［34］分别将E559和62-71-3 抗体进行人源化后形成了人鼠嵌合抗体，并利用植物表达系统成功在烟草中稳定表达了人鼠嵌合抗体E559 和63-71-3。烟草中表达的E559和62-71-3 抗体在结构、中和活性、中和广谱性与通过杂交瘤细胞表达的鼠源MAb 无区别，在仓鼠攻击模型中该嵌合抗体与商业化的HRIG 产品具有相同功效。植物表达系统也属于真核表达系统，因为其具有与哺乳动物细胞类似的细胞内机制，可正确折叠和组装抗体等复杂蛋白质［35-36］。随后TSEKOA等［37］研究也证明了利用植物表达系统表达的E559 ／62-71-3 人鼠嵌合抗体是有效的；2 种MAb 均能在体外有效中和多种狂犬病病毒株；在仓鼠暴露后攻击试验模型中，与HRIG 相比，E559 和62-71-3 起到了更强的保护作用。总体来说，植物表达系统以其低廉的生产成本，植物组装和修饰MAb 等多聚体蛋白的能力以及易于扩展的优点成为了生产MAb 经济可行的平台；利用植物平台生产的E559 ／ 62-71-3抗体组合可作为预防人类狂犬病的廉价替代品，以使发展中国家的低收入家庭受益。

9 AR16 ／ CR57

AR16 是利用3 名接种狂犬病疫苗的志愿者的外周血淋巴细胞构建噬菌体抗体库，从中筛选出可特异性识别狂犬病病毒G 蛋白上G5 表位的新型人源单链抗体［38］。通过丙氨酸扫描诱变确定G5 表位内对AR16 结合的关键氨基酸残基为261 ~ 263位氨基酸。研究者对220 个基因Ⅰ型狂犬病病毒株的G 蛋白第261 ~ 263 位氨基酸进行比对发现，AR16 结合的关键氨基酸残基高度保守，表明AR16有广谱中和狂犬病病毒株的潜质。研究者还提出将AR16 与CR57 组合使用来替代PEP，CR57 识别表位Ⅰ与CR16 的表位不重叠，因此二者表位不存在竞争；另外，通过荧光抗体中和实验（fluorescent antibody virus neutralisation test，FAVN）证明组合的CR57／AR16 中和效果高于单独使用的CR57 或AR16，提示CR57 ／ AR16 组合可提高其中和能力［39］。基于鸡尾酒疗法抗体筛选标准，仅凭研究者提供的现有结果不足以证明CR57 与AR16 可组合使用，如果想进一步确定AR16 与CR57 的组合是否为理想的RIG 替代物，一方面要通过体外中和试验确定2 个抗体对狂犬病病毒街毒株的中和情况，中和活性是否互补；另一方面要通过体内动物模型确认2 个抗体联合使用的效果不低于RIG 并对疫苗的干扰作用不高于RIG。

WHO 在2018 年4 月发表的关于狂犬病疫苗和免疫球蛋白的最新文件中指出，应更加谨慎地使用RIG，并鼓励使用MAb 产品代替RIG，开发包含2 种或多种表位不重叠的MAb 产品，以提高对狂犬病病毒株中和的效力和广度［31］。已获批及正处于临床试验阶段的狂犬病病毒MAb 见表2。迄今为止，关于狂犬病病毒的MAb 发展最快的产品为印度PVT 血清研究所生产的Rabishield（2016 年获批，2017 年上市）；另外还有4 种处于临床试验阶段，其中Rabimabs 已经完成Ⅲ期临床试验，数据正在分析中，而CL184 在完成Ⅰ、Ⅱ临床后退出了产品开发。

表2 已获批和正处于临床试验阶段的狂犬病病毒MAb 产品Tab.2 MAbs against RV approved and in clinical trials

10 结 语

经过对狂犬病病毒G 蛋白及其表位的多年研究，国内外均报道了较多具有临床应用前景的抗狂犬病病毒MAb，这些MAb 将来必定会取代RIG。但在选择可诱导MAb 生成具有中和活性MAb 表达系统时，需重点考虑所选表达系统中蛋白质是否可发生正确折叠及糖基化。一旦获得高效的中和性MAb后还应进一步考虑其成药性、生产成本、效率和纯化的简便性，以及产品质量、数量和后续应用安全性；另外，也有必要考虑临床试验和进入市场所需时间，以及相关法律法规。