龚志远，张梦瑶，金宏丽，黄培，张海丽，李媛媛，王化磊

吉林大学动物医学学院人兽共患病研究教育部重点实验室，吉林 长春 130062

产肠毒素型大肠埃希菌（enterotoxigenic Escheri- chia coli，ETEC）是引起仔猪腹泻最常见的致病菌之一，常存在于人类、温血动物等的胃肠道中［1］。根据统计数据表明，猪疫病中腹泻发病率高达42.49%，由腹泻导致猪死淘率高达29%［2］。其中，由ETEC引起的断奶或初生仔猪腹泻发病率和死亡率较高，对仔猪养殖业造成巨大的经济损失［3］。此外，ETEC 还是引起婴幼儿腹泻的一种重要的人兽共患病原菌。

研究发现，ETEC 分泌的大肠埃希菌不耐热肠毒素（Escherichia coli heat-labile enterotoxin，LT）主要由A 亚基和B 亚基组成，根据其B 亚基氨基酸序列的差异将LT 分为Ⅰ型、Ⅱ型［4］，LT-Ⅰ型是重要的毒性来源，而LT-Ⅱ型不具备肠毒素活性，不会引发动物疾病。LT-ⅠA 亚基（LTA）相对分子质量约为28 000，是主要的毒性中心，该蛋白通过增加肠细胞中环腺苷酸的浓度来激活腺苷酸环化酶，并诱导脱水［5］。LT-ⅠB 亚基（LTB）是相对分子质量约为60 000 的五聚体，本身无毒性，其与神经节苷脂GM1 受体结合后可介导LTA 进入肠细胞，进而导致仔猪腹泻。LTB 还可促进树突状细胞的增殖、发育，从而增强其抗原提呈能力［5-7］，被证实为一种重要的黏膜免疫佐剂［8-10］。由于LT 是ETEC 的主要毒力因子之一，LTB含有其主要抗原位点［11］，研究LTB 致病机理和免疫原性对预防和控制大肠埃希菌引起的腹泻性疾病具有重要意义。

本研究利用大肠埃希菌原核表达LTB 蛋白，并制备其兔源多克隆抗体，以期为ETEC 疾病的诊断及LTB 黏膜免疫佐剂特性的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及细胞 原核表达载体pET30a（+）、真核表达载体pCAGGS-GST、293T 细胞和NA 细胞均由吉林大学人兽共患病研究教育部重点实验室病毒病研究室构建并保存；Stellar 感受态细胞购自宝日医生物技术（北京）有限公司；大肠埃希菌BL21（DE3）购自北京全式金生物技术股份有限公司。

1.2 实验动物 清洁级大耳白家兔2 只，6 月龄，雌性，体重2 500 g，购自长春市盛隆实验动物科技有限公司，动物合格证号：202100036554。本实验均以科研为目的对所购置的大耳白家兔进行养殖和使用，且按照《国家实验动物管理法规》（国务院令第676 号）动物伦理相关规定进行。

1.3 主要试剂及仪器 限制性核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、BCA 蛋白浓度测定试剂盒及小鼠抗His 单克隆抗体均购自美国Thermo 公司；TMB 显色液和卡那霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；FITC 标记的羊抗兔IgG 和HRP 标记的山羊抗兔IgG 为美国Bio-world 公司产品；T4 DNA 连接酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；His-Ni 纯化柱购自德国QIAGEN 公司。

1.4 引物设计及合成 根据GenBank 公布的LTB基因序列（FJ407053.1），应用Primer premier 5 软件设计LTB 序列扩增引物，LTB-F：5′-ATTCATATGGCACCACAAAGTATCACTGAA-3′，LTB-R1：5′-ACCAGAACCACCACCAGAACCACCATTTTCCATGGAGATAGCGG-3′，LTB-R2：5′-ATACTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGATGATGACCAGAACCACCACCAGAAC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 LTB 基因的扩增 根据GenBank 公布的LTB基因序列（FJ407053.1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成目的基因片段。以合成的LTB 序列为模板，分别用设计的上下游引物进行两步PCR，得到带有linker 与8 × His 的目的片段。第1 步PCR 反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，68 ℃（LTB-F、LTB-R1）退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。第2 步PCR 反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，70 ℃（LTB-F、LTB-R2）退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.6 重组原核表达质粒的构建 将切胶回收的目的片段与原核表达载体pET30a（+）分别用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，回收目的基因片段和载体片段，用T4 DNA 连接酶16 ℃连接过夜。将连接产物转化至Stellar 感受态细胞中，挑取单克隆进行双酶切鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序正确的重组质粒命名为pET30a（+）-LTB-8 × His。

1.7 目的基因的诱导表达 将鉴定正确的重组原核表达质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3），37 ℃培养过夜，挑取单菌落，于37 ℃，200 r ／ min 培养12 h 后保存菌种。用含50 μg ／ mL 卡那霉素的LB 培养基，于37 ℃培养重组菌及pET30a（+）空载体转化菌，菌液A600为0.4 ～0.6 时，加入0.4 mmol ／ L IPTG，37 ℃诱导表达6 h，收集未诱导重组菌、诱导后重组菌、未诱导pET30a（+）空载体、诱导后pET30a（+）空载体，进行10% SDS-PAGE 鉴定。

1.8 目的蛋白表达条件的优化及表达形式的鉴定

1.8.1 IPTG 诱导浓度的优化 将重组菌于37 ℃，200 r ／ min 培养3 h 左右，分别用0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mmol ／ L 的IPTG 诱导5 h，表达产物进行10% SDS-PAGE 分析，筛选最佳IPTG 诱导浓度。

1.8.2 IPTG 诱导时间的优化 将重组菌于37 ℃，200 r ／ min 培养3 h 左右，加入0.4 mmol ／ L IPTG，分别诱导1、2、3、4、5、6、7、8 h，表达产物进行10%SDS-PAGE 分析，筛选最佳诱导时间。

1.8.3 IPTG 诱导温度的优化及表达形式的鉴定将重组菌分别于16、25、30、37 ℃，用0.4 mmol ／ L IPTG 诱导5 h，溶菌酶进行裂解，分别取菌液上清、裂解上清、裂解沉淀进行10% SDS-PAGE 分析，筛选最佳诱导温度，并确定目的蛋白的表达形式。

1.9 目的蛋白的纯化 在最佳诱导条件下培养400 mL菌液，4 ℃，9 800 × g 离心10 min，弃上清，将菌体用20 mL 平衡液（含8 mol ／ L 尿素、0.01 mol ／ L 咪唑）重悬，进行包涵体蛋白的变性，超声破碎至菌液澄清，将裂解后的菌液4 ℃，9 800 × g 离心10 min，收集上清，与His-Ni 柱填料4 ℃结合过夜，分别用250、500 mmol ／L 的咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。将洗脱的目的蛋白依次用透析液1（含5 mol ／ L 尿素、5 mol ／ L咪唑）、透析液2（含2.5 mol ／ L 尿素、2 mol ／ L 咪唑）各透析8 h，进行蛋白复性。纯化后的蛋白进行10% SDS-PAGE 分析，并采用BCA 法测定蛋白浓度，置于-80 ℃冰箱保存备用。

1.10 多克隆抗体的制备 将等体积的纯化后重组蛋白LTB 与弗氏完全佐剂混合并乳化后，通过皮下注射方式免疫大耳白家兔，每只抗原剂量500 μg。初次免疫后每隔14 d 进行加强免疫，佐剂均为弗氏不完全佐剂，共免疫5 次。末次免疫后1 周经心脏采血，分离血清，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.11 多克隆抗体的鉴定

1.11.1 反应性鉴定 采用Western blot 法。将LTB序列酶切连接入真核表达载体pCAGGS-GST，构建真核表达质粒pCAGGS-GST-LTB，与空载体pCAGGSGST 分别转染293T 细胞，48 h 后收集细胞，4 ℃，300 × g 离心10 min，弃上清，沉淀中加入RIPA 裂解液裂解，收取蛋白，经10% SDS-PAGE 分离后，转印至NC 膜上。将NC 膜用含5%脱脂奶粉的PBS 溶液在室温条件下封闭2 h；加入免疫血清（1 ∶200 稀释），4 ℃孵育过夜；1 × PBST 洗涤，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG（1 ∶20 000 稀释），室温孵育1 h；洗涤后凝胶成像系统分析结果。

1.11.2 间接免疫荧光检测（indirect immunofluore-s cence assay，IFA） 将构建的真核表达质粒pCAGGSGST-LTB 与空载体pCAGGS-GST 分别转染NA 细胞，转染后48 h 弃上清，以80%冷丙酮室温固定30 min；PBS 洗涤3 次，加入LTB 蛋白多克隆抗体（用含1% BSA 的PBST 溶液1 ∶200 稀释），37 ℃孵育1 h；PBST 洗涤5 次，加入FITC 标记的羊抗兔IgG（1 ∶200 稀释），37 ℃避光孵育1 h；PBST 洗涤5 次，置于荧光显微镜下观察结果。

2 结 果

2.1 LTB 基因扩增产物的鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳分析显示，通过两步PCR 扩增得到357 bp 的目的基因片段，见图1。

图1 LTB 基因PCR 扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of LTB gene

2.2 重组原核表达质粒的鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳分析显示，重组质粒pET30a（+）-LTB-8 × His 经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，可见357 bp 的目的基因条带，见图2。测序结果表明，重组质粒构建正确。

图2 重组原核表达质粒pET30a（+）-LTB-8 × His 的双酶切（NdeⅠ／ XhoⅠ）鉴定Fig.2 Restriction map of recombinant plasmid pET30a（+）-LTB-8 × His（NdeⅠ／ XhoⅠ）

2.3 表达产物的鉴定 10% SDS-PAGE 分析显示，重组质粒诱导后菌液在相对分子质量约13 000 处出现目的条带，大小与预期相符，而空载体菌液未出现目的条带，见图3。

图3 表达产物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE profile of expressed product

2.4 目的蛋白最佳表达条件及表达形式

2.4.1 最佳IPTG 诱导浓度 10%SDS-PAGE 分析显示，IPTG 浓度大于0.4 mmol ／ L 后，目的蛋白的表达量并无明显变化，见图4。因此选择0.4 mmol ／ L为最佳IPTG 诱导浓度。

图4 不同浓度IPTG 诱导LTB 表达的SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE profile of LTB expressed under induction of IPTG at various concentrations

2.4.2 最佳诱导时间 10% SDS-PAGE 分析显示，0.4 mmol ／ L IPTG 诱导4 h 后，目的蛋白的表达量并无明显增加，见图5。因此选择4 h 为最佳诱导时间。

图5 不同诱导时间LTB 表达的SDS-PAGE 分析Fig.5 SDS-PAGE profile of LTB expressed after induction for various hours

2.4.3 最佳诱导温度及表达形式 10% SDS-PAGE分析显示，在30 ℃时目的蛋白的表达量最高，因此选择30 ℃为最佳诱导温度；目的蛋白的表达形式为包涵体表达。见图6。

图6 不同诱导温度LTB 表达及其表达形式的SDSPAGE 分析Fig.6 Analysis of expression form of LTB induced at various temperatures by SDS-PAGE

2.5 纯化重组蛋白的鉴定 纯化的重组蛋白经10% SDS-PAGE 分析，可见相对分子质量约13 000的目的蛋白条带，见图7。BCA 法测得蛋白浓度为3.7 mg ／ mL。

图7 纯化产物的SDS-PAGE 分析Fig.7 SDS-PAGE profile of purified target protein

2.6 多克隆抗体的鉴定

2.6.1 反应性 Western blot 分析显示，重组真核表达质粒pCAGGS-GST-LTB 转染组在相对分子质量约35 000 处可见特异性条带，而空载体pCAGGS-GST转染组未见条带，见图8。表明制备的多克隆抗体能特异性识别LTB 蛋白。

图8 多克隆抗体的Western blot 鉴定Fig.8 Western blotting of polyclonal antibody

2.6.2 IFA IFA 检测结果显示，重组真核表达质粒pCAGGS-GST-LTB 转染组可见亮绿色荧光斑点，而空载体pCAGGS-GST 转染组未见该荧光斑点，见图9。表明制备的多克隆抗体能与LTB 蛋白发生特异性反应。

图9 LTB 蛋白多克隆抗体的IFA 检测Fig.9 IFA of polyclonal antibody against LTB

3 讨 论

LTB 因其无毒性，且具有良好的免疫原性及佐剂活性，可用于ETEC 疾病的诊断和作为黏膜免疫佐剂使用［12-14］。本研究构建了重组原核表达质粒pET30a（+）-LTB-8 × His，成功表达了融合蛋白LTB，并优化了蛋白的表达条件，实现了LTB 重组蛋白的高效表达。用纯化后的重组蛋白免疫大耳白家兔，得到特异性与反应性均良好的多克隆抗体，并成功应用于LTB 的Western blot 与IFA 检测。

当前LTB 主要通过人工表达系统制备，但重组LTB 蛋白存在表达量低、无法以天然构象发挥作用等问题。常用的酵母表达系统具有可对复杂蛋白质进行后续加工和修饰、发酵规模大等优点，但存在蛋白表达不稳定、产生的副产物具有一定毒性或导致目的蛋白产量下降等缺点［15］。陈明等［16］将酵母分泌性表达载体pPIC9K-LTB 电转化酵母菌KM71，发现构建的重组酵母菌可分泌表达LTB，且具有免疫原性。乳酸菌表达系统具有制备简单、无内毒素、目的蛋白可与菌体一同服用等优点，但乳酸菌表达系统目前尚不成熟，存在外源蛋白表达效率不高等问题［17］。付锦楠等［18］构建了干酪乳杆菌分泌型表达重组质粒pMG36e-UP ／ L-LTB，电转化干酪乳杆菌393，筛选获得重组干酪乳杆菌，表达的LTB 蛋白具有免疫活性。大肠埃希菌表达系统具有生长速度快、易于培养、遗传背景清晰、操作简单、可高效表达等优势。在大肠埃希菌表达系统中，不同的表达载体与纯化标签在一定程度上决定了蛋白的表达形式及纯化效果，因此，选取一种合适的表达载体与纯化标签组合在蛋白表达与纯化过程中显得尤为重要。何月等［19］采用冷休克载体pCold-TF 表达LTB，结果表明，LTB 蛋白主要以可溶性形式存在于上清中，同时，通过6 × His 标签对目的蛋白进行纯化，得到纯度良好的LTB 蛋白。谢婷婷等［20］构建了重组质粒pET32a-LTB，表达的6×His-LTB 融合蛋白用Ni2+-NTA 树脂进行纯化，纯化的融合蛋白具有良好的免疫活性和佐剂活性。雷清等［21］将重组质粒pET21b-LTB转化入大肠埃希菌BL21 感受态细胞，采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化，纯化的LTB 蛋白具有黏膜免疫佐剂作用。本研究选取大肠埃希菌表达系统将LTB 序列通过柔性肽Linker 与8 × His 标签相连接，并将目的基因连接至pET30a（+）表达载体，在大量表达目的蛋白的同时，将8 × His 纯化标签充分展示在融合蛋白之外，大大增加了融合蛋白与His-Ni 柱的亲和能力。同时优化了IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间等条件，提高了融合蛋白的产量，也为其他外源蛋白表达与纯化技术优化提供了思路。

LTB亚基是大肠埃希菌LT 的重要组成部分，本身无毒性且具有良好的免疫原性［22］，因此，纯化的LTB 蛋白可与多种ETEC 黏附素抗原联合免疫，进而为机体提供广泛的保护力［23-24］。LTB还具有黏膜免疫佐剂活性，可作为佐剂与抗原联合使用增强免疫效果［25-26］。因此，本研究制备的LTB 重组蛋白可应用于诊断方法的建立、疫苗制备、分子佐剂研究等多方面，所制备的多克隆抗体也可应用于Western blot、IFA、ELISA 等检测技术，为ETEC 疾病的诊断、疫苗研究等奠定了基础。